Summary
的解剖技术说明组织固定，进行表型的高通量筛选老鼠的眼睛剜除术。
Abstract
老鼠的眼睛是一个重要的遗传模型的平移人类眼科疾病的研究。在转基因小鼠在人类的致盲性疾病，如黄斑变性，光感受器变性，白内障，青光眼，视网膜母细胞瘤，糖尿病性视网膜病变已概括。1-5大多数转基因和基因敲除小鼠的实验室研究已产生非眼科疾病，但器官系统之间的遗传保护，许多相同的基因也可能在眼发育和疾病发生中发挥作用。因此，这些老鼠的眼睛发现新的基因型与表型的相关性是一个重要的资源。由于这些老鼠分散在世界各地，它是难以获取，维护和表型以高效，成本效益的方式。因此，大多数高通量眼表型屏幕被限制在检查现场，眼科专业知识，需要几个地点的眼睛在活体小鼠6-9本实验室所开发的另一种方法是远程组织收购，可用于转基因小鼠的眼睛在或大或小规模的调查方法。基于视频的手术技术转移，组织固定和运输的标准化程序允许任何实验室收集整个眼睛突变的动物，并将它们发送的分子和形态学表型。在这个视频文章中，我们提出了远程表型分析技术enucleate和转让不固定，并灌注固定鼠标的眼睛。
Protocol
1。在不固定的标本钝性分离：老鼠的眼睛剜除术
- 拉开眼睑改善及接触后的地球（眼球）表面。
- 将弯曲敷料镊子背后（下）的地球轨道（眼圈）。马哈詹Sharptip敷料镊子尖这一步更容易（见材料和试剂表）是一个自定义的仪器。
- 关闭的镊子和把握的轨道结缔组织和视神经背后的全球，同时小心避免挤压全球。
- 轻轻向上拉镊子和勇敢的眼球从眼眶。白线样组织是视神经。
- 将在PBS中的眼睛。使用30号针头，使一个单一的穿刺卷绕紧接后方插入针1-2毫米到眼球的角膜缘。这允许固定剂，如戊二醛，否则无法穿透眼组织，直接连接进入眼睛。创作本穿刺伤口可能不是必要的，如果一种固定剂，如多聚甲醛或酒精，能够扩散到眼组织的利益。
- 将整个眼睛马上进入固色剂浸泡固定。
2。锐性剥离：老鼠的眼睛剜除以下灌注固定
- 使用弯曲的科利柏镊子，保持眼睑远离地球。
- 东方弯曲的Westcott解剖剪刀平行于地球，而针对朝后面的轨道。
- 切固定的结缔组织，从下，内，优越，和侧面围绕着地球。
- 将弯曲的镊子落后于世界各地，掌握结缔组织，而不按在地球上，并向前拉，enucleate的眼睛。由于灌注固定的轨道结缔组织僵硬，眼眶组织可能需要额外的切割，完全释放的globE。
3。固定和包装
运输必须遵循固定的组织机构和邮政服务的需求，包括适当的标签和包装。下面的协议是出货非传染性生物样品在室温下的一个例子。这需要3层包装，但没有A / B类生物物质或液态氮的标签。
- 到5毫升的玻璃闪烁瓶中至少3 mL的固色剂，固色剂缓冲，如果将眼睛固定短。发表在盖子上的小瓶中的跟踪号码和密封用Parafilm。
- 将闪烁瓶到生物样品经认可的装运容器。在我们的研究所，例如，规定的容器内，需要三个层：将样品置于一个密封的容器，其中，吸收的中间层，和一个外保护层。
- 成泡沫包装到一个应用程序包，然后将容器忙得不亦乐乎实验室海运集装箱以及适当的文件。
4。代表性的成果
组织学检查的眼睛可以进行苏木精和曙红染色，酶的表达检测，透射电子显微镜，和免疫组织化学的方法，包括由多种。浸泡在4％多聚甲醛固定后，组织包埋在石蜡切片切片机上。在高通量的表型，我们分析学生视神经部分样品，所有组织类型的眼睛（图1）。组织切片也审查lacZ的表达（图2），透射电子显微镜观察细胞器（图3），并与抗体（图4）的特定的分子的表达。
在我们的表型筛选的方法，这不是重要的是保持眼睛的方向与鼻（内眦）和时间（侧位片升眦）的两侧。有至少两个选项，如果眼睛的方向是必要的。后摘除术，我们已经申请了光烧灼角膜的时间在三点钟位置，用手持烧灼设备。病变在组织学上是明显的，像组织的油墨在加工过程中不会丢失。缺点是，烧灼损害角膜，这可能是一个重要的组织检查。其他选项需要一个熟练的的解剖学家，可以识别眼外肌插入。在立体显微镜下，识别的劣质和优越的斜肌插入，马克劣势和优越的方面的全球3使用任一方向方法，重要的是作为右或左眼跟踪试样。总之，这将使全球的定位准确之前，切片。
图1。小鼠眼组织学图像杨宗亮 R远程采集。鼠标的眼睛去核锐性剥离后，用4％多聚甲醛灌注固定。A.学生与苏木精和曙红染色显示视神经节保存的所有组织子结构。 ON，视神经。 （绿色比例尺= 500微米）B.较高的放大视图的正常视网膜显示其层状结构：RGC，视网膜神经节细胞，IPL，内丛状层; INL，内核层; OPL，外丛状层（ONL），外核层（感光细胞）（箭头）; IS，感光体的内段（箭头的头）; OS中，光感受器外段; RPE，视网膜色素上皮细胞，C，脉络膜。 （绿色比例尺= 50微米）C.与正常视网膜相比，这个标本是薄由于光感受器变性。 ONL，IS，OS是完全不存在的（箭头）。 （绿色比例尺= 50微米）
“ALT =”图2“/>
图2。lacZ的表达，在转基因小鼠中，眼睛摘除钝性分离和浸渍在1毫克/毫升X-gal的溶液（5mM的的K3Fe（CN）6，5mM的亚铁氰化钾（CN）6，2 mM MgCl2的，0.02％NP40 ，和0.1％脱氧胆酸钠）中过夜，在37℃下眼睛被固定在30分钟，然后切片截面2％formaldehyde/0.2％戊二醛。 X-gal的产品（蓝色）标签：A.纤毛上皮细胞，角膜上皮B. C.在视网膜视网膜神经节细胞（RGC）层。 INL，外核层（ONL），外核层。
图3。透射电子显微镜的视网膜色素上皮细胞（RPE）。钝性分离后创造的穿刺伤口，眼睛浸泡在0.1M磷酸钠缓冲液在2.5％的多聚甲醛/ 2.5％戊二醛固定。眼睛是次生在1％锇textroxide的darily固定，逐渐脱水，和嵌入在Spurr树脂。组织在90处被切开，并放置到铜槽网格覆盖福尔瓦和成像使用透射电子显微镜。显微照片显示，光感受器外节的视网膜神经，视网膜色素上皮细胞内的黑色素体（M），和Bruch膜。
图4。超氧化物歧化酶（SOD）的免疫组化标记（绿色）鼠标玻璃体摘除眼球钝性分离，并接受了4％多聚甲醛浸泡固定。他们被嵌入在石蜡切片用切片机。组织切片孵育，与多克隆SOD3抗血清1:50稀释。 SOD3表达检测使用的山羊抗兔IgG（H + L）的Alexa Fluor 488的共轭次级抗体。在GRE标签SOD3恩。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
大多数转基因小鼠中存在的不检查眼睛的实验室。我们的视频技术，说明了一个简单的，标准化的方法，用于远程手术技巧转移到优化组织收购，从实验室经验少用眼。此视频技术可以帮助克服在高通量的表型，这是由于非标准化组织收集和固定方法，防止有意义的比较表型和分子生物学研究的专业网站的使用数量有限的一个主要缺陷。任何新的远程实验室和技术人员，建立和保持质量控制，重要的是开始，并定期在整个研究包括野生型的眼睛。我们还发现，一个跟踪系统是重要的，当多个从多个基因型的眼睛被转移，如基于Web的系统分配一个唯一的识别号码，每只眼睛。虽然更高质量的固定和随后的组织切片得到灌注固定动物，我们发现，摘除不固定的动物标本是足够了最形态学和分子生物学研究。此外，收购不固定的动物的眼睛可能会更容易处理的高通量研究，从不同的来源。转基因小鼠是研究人类眼科疾病，10日，11日和远程组织收购当地表型，使这一宝贵资源的一个重要工具。应用了类似的策略组织解剖和共享的表型的高通量非眼科组织产生重要的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
研究以预防失明，主任朱尔斯·斯坦眼科研究所，加州大学洛杉矶分校Bartly J. Mondino MD和拉米罗·拉米雷斯 - 索利斯，杰奎白，和珍妮Estabel的，威康信托基金会桑格研究所基因组校园。本研究符合ARVO声明眼科和视觉研究中使用动物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
