Summary
De dissectie techniek illustreert enucleatie van de muis oog voor weefsel fixatie te fenotypering presteren in high-throughput-schermen.
Abstract
De muis is een belangrijke eye genetisch model voor de studie van menselijke translationele oogziektes. Blinding ziekten bij de mens, zoals maculadegeneratie, fotoreceptor degeneratie, cataract, glaucoom, retinoblastoom, en diabetische retinopathie zijn samengevat in transgene muizen. Een-vijf meeste transgene en knock-out muizen zijn van laboratoria die aan niet-oogheelkundige aandoeningen te bestuderen, maar genetische conservering tussen orgaansystemen suggereert dat veel van dezelfde genen kunnen ook een rol spelen bij ontwikkeling en oculaire ziekte. Vandaar dat deze muizen vormen een belangrijke bron voor het ontdekken van nieuwe genotype-fenotype correlaties in het oog. Omdat deze muizen zijn verspreid over de hele wereld, is moeilijk te verwerven, onderhouden en fenotype ze op een efficiënte en kosteneffectieve manier. Zo zijn de meeste high-throughput oogheelkundige fenotypering schermen beperkt tot enkele locaties die nodig on-site, oogheelkundige expertise om de ogen te onderzoeken in levende muizen. 6-9 Een alternatieve benadering die door ons laboratorium is een werkwijze voor remote weefsel acquisitie die gebruikt kunnen worden in kleine of grote schaal onderzoek van transgene muizen ogen. Gestandaardiseerde procedures voor video-gebaseerde chirurgische vaardigheden overdracht, weefsel fixatie, en de scheepvaart ervoor dat er geen lab op hele ogen te verzamelen van gemuteerde dieren en stuur ze voor de moleculaire en morfologische fenotypering. In deze video artikel zullen we technieken om ophelderen en zowel losgemaakte en perfusie vaste muis ogen dragen voor het op afstand fenotypering analyses.
Protocol
1. Stompe dissectie: Enucleatie van de muis oog in gefixeerde monsters
- Uit elkaar trekken van de oogleden om de blootstelling en de toegang tot de achterste wereld (oogbol) oppervlak te verbeteren.
- Plaats een gebogen dressing pincet achter (onder) de hele wereld in de baan (oogkas). De Mahajan Sharptip dressing pincet is een aangepaste instrument met spitse tips om deze stap te vergemakkelijken (zie materialen en reagentia tabel).
- Sluit de pincet en pak de orbitale bindweefsel en de oogzenuw achter de wereldbol terwijl ze voorzichtig om te voorkomen dat het knijpen in de hele wereld.
- Voorzichtig omhoog te trekken het pincet en plukken de oogbol van de baan. De witte draad-achtig weefsel is de oogzenuw.
- Plaats het oog in PBS. Met een 30-gauge naald een enkele steekwond onmiddellijk achter de limbus door de naald 1-2 mm in de oogbol. Dit maakt fixatieven, zoals glutaaraldehyde, die anderszins niet het oogweefsel dringen direct enter het oog. Creatie van deze steekwond niet nodig indien een fixeermiddel, zoals paraformaldehyd of alcohol, kan diffunderen in oogweefsels plaats.
- Plaats de hele oog onmiddellijk in fixatief voor onderdompeling fixatie.
2. Sharp Dissectie: Enucleatie van de muis oog volgende perfusiefixatie
- Gebruik een gebogen colibri pincet om het ooglid te houden uit de buurt van de hele wereld.
- Orient gebogen Westcott dissectie schaar parallel aan de hele wereld, waarbij het de bedoeling in de richting van de achterkant van de baan.
- Snijd de vaste bindweefsel dat de hele wereld rond van de inferieure, mediale, superieur, en zijkanten.
- Plaats de gebogen pincet achter de wereldbol, pakt u het bindweefsel, zonder te drukken op de hele wereld, en naar voren trekken voor het oog ophelderen. Sinds de orbitale bindweefsel is stijf van perfusiefixatie kunnen aanvullende snijden van orbitale weefsels noodzakelijk om deze volledig los van de globe.
3. Fixatie en verpakking
Verzenden van vaste weefsels moeten volgen van uw instelling en postdiensten eisen met inbegrip van passende etiketten en verpakkingen. Het volgende protocol is een voorbeeld van de scheepvaart een niet-infectieuze biologische monster bij kamertemperatuur. Hiervoor zijn 3 lagen van de verpakking, maar geen klasse A / B biologische stof of vloeibare stikstof labels.
- Plaats het oog in een 5 mL glazen scintillatieflesje met ten minste 3 ml fixeermiddel of post-buffer als fixeermiddel fixatie kort. Vermeld het trackingnummer op het deksel van de flacon en sluit deze af met Parafilm.
- Plaats scintillatieflesjes in een biologisch monster goedgekeurde verzenddoos. In ons instituut, bijvoorbeeld goedgekeurd containers moeten drie lagen: een gesloten houder waarin het monster wordt een absorberende tussenlaag en een beschermende buitenlaag.
- Plaats de container in een bubble-wrap pakket en vervolgens in een appdwaalden laboratorium container samen met de juiste documentatie.
4. Representatieve resultaten
Histologisch onderzoek van de ogen kan worden uitgevoerd door een verscheidenheid aan werkwijzen, waaronder hematoxyline en eosine kleuring, enzymatische detectie expressie, transmissie-elektronenmicroscopie en immunohistochemie. Na fixatie onderdompeling in 4% paraformaldehyde, werd weefsel ingebed in paraffine en in coupes op een microtoom. In high-throughput fenotypering analyseren we pupil-oogzenuw secties sample alle weefseltypen in het oog (figuur 1). Secties van weefsel werden onderzocht voor lacZ expressie (Figuur 2), transmissie-elektronenmicroscopie van celorganellen (figuur 3), en expressie van specifieke moleculen met antilichamen (Figuur 4).
In onze fenotype screening methode was niet belangrijk oriëntatie van het oog te houden ten opzichte van de nasale (mediale ooghoek) en temporele (lateral canthus) kanten. Er zijn minstens twee opties als eye oriëntatie nodig. Na enucleatie, hebben we toegepast licht brandijzer op de tijdelijke hoornvlies op de drie uur positie met een handheld cauterisatie-apparaat. Het letsel is duidelijk op de histologie en niet verdwalen tijdens de verwerking als histologische inkten. Het nadeel is dat brandijzer schade toebrengt aan het hoornvlies, die een kritische weefsel voor onderzoek zijn. De andere optie is een ervaren anatoom die kan identificeren van de oculaire spier inserties. Onder een stereomicroscoop, identificatie van de lagere en hogere obliquus insteekmarkeringen de lagere en hogere en aspect van de wereld. 3 Met beide oriëntaties werkwijze, is het belangrijk om het monster te houden terwijl een rechter of linker oog. Samen zullen deze voorafgaande kan Exact Globe oriëntatie op het snijden.
Figuur 1. Muis oog histologische beelden afte r remote acquisitie. Mouse ogen werden verwijderd door scherpe dissectie na perfusie fixatie met 4% paraformaldehyde. A. Leerling-oogzenuw gedeelte gekleurd met hematoxyline en eosine toont behoud van alle weefsels substructuren. ON, oogzenuw. (Groen schaal bar = 500 micron) B. Een hogere vergroting beeld van het normale netvlies toont haar gelaagde structuur: RGC, retinale ganglioncellen, IPL, innerlijke plexiform laag; INL, binnenste nucleaire laag; OPL, buitenste plexiform laag; ONL, buitenste nucleaire laag (fotoreceptorcel) (pijl); IS, fotoreceptor innerlijke segmenten (pijlpunt), OS, fotoreceptor buitenste segmenten, RPE, retinale pigment epitheel, C, choroidea. (Groen schaal bar = 50 micron) C. Vergeleken met de normale retina, dit exemplaar dunner door fotoreceptor degeneratie. De ONL, IS en OS zijn volledig afwezig (pijl). (Groen schaal bar = 50 micron)
"Alt =" Figuur 2 "/>
Figuur 2. LacZ expressie in transgene muizen. Ogen werden verwijderd door stompe dissectie en ondergedompeld in 1 mg / ml X-gal oplossing (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM K4Fe (CN) 6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP40 en 0,1% natriumdeoxycholaat) nacht bij 37 ° C. Ogen werden gefixeerd in 2% formaldehyde/0.2% glutaaraldehyde gedurende 30 minuten en doorgesneden op een microtoom. X-gal product (blauw) labels: A. ciliaire epitheel, B. hoornvliesepitheel en C. de retinale ganglion cel (RGC) laag in het netvlies. INL, binnenste nucleaire laag; ONL, buitenste nucleaire laag.
Figuur 3. Transmissie elektronenmicroscopie van retinale pigment epitheel (RPE). Na stompe dissectie en de oprichting van een steekwond, ogen waren onderdompeling gefixeerd in 2,5% paraformaldehyde / 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumfosfaatbuffer. Ogen waren Secondarily gefixeerd in 1% osmium textroxide geleidelijk gedehydrateerd en ingebed in Spurr hars is. Weefsel werd doorsneden bij 90 nm en geplaatst op koperen roosters slot bedekt met Formvar en afgebeeld met een transmissie-elektronenmicroscoop. De microfoto toont, fotoreceptor buitenste segmenten van de neurosensorische retina, melanosomen (M) in het retinale pigment epitheel en Bruch's membraan.
Figuur 4. Immunohistochemische labeling van superoxide dismutase-3 (groen) in de muis glasvocht. Ogen werden verwijderd door stompe dissectie en fixatie onderging onderdompeling in 4% paraformaldehyde. Ze werden ingebed in paraffine en in coupes met een microtoom. Weefselcoupes werden geïncubeerd met konijn polyklonaal SOD3 antiserum 1:50 verdund. SOD3 expressie werd gedetecteerd met een geit anti-konijn IgG (H + L)-Alexa Fluor 488 geconjugeerd secundair antilichaam. Labeling van SOD3 getoond in green.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meeste transgene muizen bestaan in laboratoria die niet onderzoekt de ogen. Onze video-techniek illustreert een eenvoudige, gestandaardiseerde methode voor het op afstand chirurgische vaardigheid transfer naar weefsel overname optimaliseren van laboratoria met weinig ervaring met de ogen. Deze techniek helpt video overwinnen belangrijke valkuil in high-throughput fenotypering, die het gebruik van een beperkt aantal locaties deskundige door niet-gestandaardiseerde weefselverzameltoestel en bevestigingsmethoden die bruikbare fenotypische en moleculaire vergelijkende studies voorkomen. Om vast te stellen en te handhaven kwaliteitscontrole met een nieuwe remote lab en technicus, is het belangrijk om wild-type ogen zijn aan het begin en op gezette tijden gedurende het onderzoek. We vonden ook dat een tracking systeem belangrijk is wanneer er meerdere ogen van meerdere genotypes werden overgebracht, zoals een web-based systeem om een uniek identificatienummer toe te kennen aan elk oog. Hoewel hogere kwaliteit fixatie en daaropvolgende weefselsecties worden verkregen metperfusie-gefixeerde dieren, vinden we dat de specimens ontkernde van niet vastgelegde dieren voldoende voor de meeste morfologische en moleculaire studies. Bovendien kan verwerven van ogen gefixeerde dieren aanzienlijk gemakkelijker te verwerken in high-throughput studies van verschillende bronnen. Transgene muizen zijn een belangrijk instrument voor het onderzoeken van humane oculaire ziekte, 10, 11 en afstand weefsel aanwinst voor de lokale fenotypering maakt optimaal gebruik van deze waardevolle hulpbron. Toepassing van een soortgelijke strategie voor weefsel dissectie en het delen kunnen een belangrijke invloed hebben op high-throughput fenotypering van niet-oogheelkundige weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Onderzoek naar blindheid te voorkomen; Bartly J. Mondino MD, directeur van het Jules Stein Eye Institute, UCLA, en Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui Wit, en Jeanne Estabel aan het Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus. Dit onderzoek voldoet aan de Arvo verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Visual Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
