Summary
La technique de dissection illustre énucléation de l'oeil de la souris pour la fixation des tissus pour réaliser le phénotypage à haut débit écrans.
Abstract
L'œil de la souris est un modèle important pour l'étude génétique de translation de la maladie ophtalmique humaine. Prévenir la cécité chez l'homme, telles que la dégénérescence maculaire, la dégénérescence des photorécepteurs, la cataracte, le glaucome, le rétinoblastome, et la rétinopathie diabétique ont été récapitulés dans les souris transgéniques. 5.1 La plupart des souris transgéniques et knock-out ont été générées par les laboratoires pour étudier les maladies non ophtalmiques, mais conservation des ressources génétiques entre les systèmes d'organes suggère que bon nombre des mêmes gènes peuvent également jouer un rôle dans le développement oculaire et les maladies. Par conséquent, ces souris constituent une ressource importante pour la découverte de nouvelles corrélations génotype-phénotype dans les yeux. Parce que ces souris sont dispersés à travers le monde, il est difficile d'acquérir, de conserver et de les phénotype d'une manière efficace, rentable. Ainsi, la plupart des écrans à haut débit phénotypage ophtalmiques sont limités à quelques endroits qui ont besoin sur place, l'expertise ophtalmologique pour examiner les yeux chez des souris vivantes. 9.6 Une approche alternative développée par notre laboratoire est une méthode de tissus acquisition à distance qui peut être utilisé dans les enquêtes à petite ou grande échelle des yeux de souris transgéniques. Les procédures standardisées pour la vidéo basée sur le transfert de compétences chirurgicales, la fixation des tissus, et l'expédition permettre à tout laboratoire pour recueillir les yeux entiers à partir d'animaux mutants et les envoyer pour le phénotypage moléculaire et morphologique. Dans cet article, vidéo, nous vous présentons des techniques pour énucléer et transférer à la fois non fixées et la perfusion yeux fixes souris pour les analyses de phénotypage à distance.
Protocol
1. Dissection Blunt: énucléation de l'œil de la souris dans les échantillons non fixés
- Séparez les paupières pour améliorer la visibilité et l'accès au globe postérieure (œil) de surface.
- Placez un pansement pince courbée derrière (sous) le monde dans l'orbite (orbite de l'œil). Le Mahajan Sharptip pansement pince est un instrument de mesure avec bouts pointus pour faciliter cette étape (voir matériels et réactifs de table).
- Fermez la pince et saisir le tissu conjonctif orbitale et le nerf optique derrière le globe tout en faisant attention à ne pas écraser le monde.
- Tirez doucement sur le pince vers le haut et arracher le globe oculaire hors de l'orbite. Le fil blanc-comme le tissu est le nerf optique.
- Placez l'œil dans du PBS. En utilisant une aiguille de calibre 30, faire une ponction unique liquidée immédiatement en arrière du limbe en insérant l'aiguille 1-2 mm dans le globe oculaire. Ceci permet fixateurs, tels que le glutaraldéhyde, qui sont dans l'impossibilité de pénétrer dans le tissu oculaire, directement enter l'œil. Création de cette piqûre peut ne pas être nécessaire si un fixateur comme le paraformaldéhyde ou l'alcool, est capable de diffuser dans les tissus oculaires d'intérêt.
- Placez l'œil entier immédiatement dans fixateur pour la fixation d'immersion.
2. Dissection Sharp: énucléation de la fixation de la souris oeil perfusion suivante
- Utilisez une pince courbe colibri de tenir la paupière loin du monde.
- Orienter les courbes ciseaux à dissection Westcott parallèles au monde, tout en visant vers l'arrière de l'orbite.
- Coupez le tissu conjonctif qui entoure fixe le monde des inférieures, médianes, les côtés supérieurs et latéraux.
- Placez la pince courbée derrière le globe, tenez le tissu conjonctif sans appuyer sur le globe, et tirer vers l'avant pour énucléer l'œil. Puisque le tissu conjonctif orbitale est raide de fixation par perfusion, coupe supplémentaire des tissus orbitaires peut être nécessaire pour libérer complètement le globe.
3. Fixation et d'emballage
Livraison de tissus fixés doivent respecter vos obligations de service postal et institutionnels, y compris des étiquettes et des emballages. Le protocole suivant est un exemple de l'expédition d'un échantillon non biologique infectieux à température ambiante. Cela nécessite 3 couches de l'emballage mais pas de classe A substance / B biologiques ou des étiquettes d'azote liquide.
- Placez l'oeil dans un flacon de 5 ml à scintillation en verre avec au moins 3 ml de fixateur, ou post-fixateur de mémoire tampon si la fixation est courte. Écrivez le numéro de suivi sur le couvercle du flacon et le sceller avec du parafilm.
- Placer les flacons à scintillation dans un échantillon biologique approuvé conteneur d'expédition. Dans notre institut, par exemple, des contenants approuvés besoin de trois couches: un conteneur étanche dans lequel l'échantillon est placé, une couche intermédiaire absorbante et une couche externe protectrice.
- Placer le récipient dans un emballage plastique-bulles, puis dans une applicationparcouraient conteneur d'expédition de laboratoire ainsi que la documentation appropriée.
4. Les résultats représentatifs
L'examen histologique des yeux peut être effectuée par une variété de méthodes, y compris l'hématoxyline et coloration à l'éosine, détection de l'expression enzymatique, microscopie électronique à transmission, et l'immunohistochimie. Après fixation par immersion dans du paraformaldéhyde 4%, le tissu a été inclus dans la paraffine et sectionnés au microtome. Dans le phénotypage à haut débit, nous analysons les sections nerveuses élève optique que l'échantillon tous les types de tissus de l'œil (figure 1). Des morceaux de tissu ont également été examinées pour l'expression de lacZ (figure 2), la microscopie électronique à transmission des organites cellulaires (figure 3), et l'expression de molécules spécifiques avec des anticorps (figure 4).
Dans notre méthode de dépistage phénotype, ce n'était pas important pour maintenir l'orientation de l'oeil par rapport au nasal (canthus interne) et temporelle (lateral) canthus côtés. Il ya au moins deux options si l'orientation des yeux est nécessaire. Après énucléation, nous avons appliqué la cautérisation lumière sur la cornée temporelle à la position trois heures avec un dispositif de cautérisation de poche. La lésion est évident sur l'histologie et de ne pas se perdre pendant le traitement, comme les encres histologiques. L'inconvénient est que les dommages cautérisation de la cornée, ce qui peut être un tissu essentiel pour examen. L'autre option nécessite un anatomiste habile qui permet d'identifier les insertions musculaires extra-oculaires. Sous un stéréomicroscope, l'identification de l'insertion du muscle oblique inférieur et supérieur constitue l'aspect inférieur et supérieur et de la planète 3. Que soit la méthode d'orientation, il est important de suivre le spécimen comme l'œil droit ou gauche. Ensemble, ce qui permettra l'orientation exacte monde avant la coupe.
Figure 1. Images des yeux de souris histologiques afte r distance acquisition. yeux de souris ont été énucléés par dissection après la fixation de perfusion avec du paraformaldéhyde 4%. A. Nombre d'élèves par section du nerf optique colorées à l'hématoxyline et à l'éosine montre préservation de toutes les structures tissulaires. ON, le nerf optique. (Barre d'échelle verte = 500 microns) B. Une vue plus fort grossissement de la rétine normale montre sa structure laminaire: RGC, les cellules ganglionnaires de la rétine; IPL, couche interne plexiforme; INL, couche nucléaire interne; OPL, couche externe plexiforme; ONL, extérieur la couche nucléaire (cellules photoréceptrices) (flèche); IS, les segments des photorécepteurs internes (tête de flèche); OS, photorécepteurs segments extérieurs; RPE, l'épithélium pigmentaire rétinien; C, choroïde. (Barre d'échelle verte = 50 microns) C. Par rapport à la rétine normale, ce spécimen est plus mince en raison de la dégénérescence des photorécepteurs. L'ONL, IS et OS sont totalement absents (flèche). (Échelle bar vert = 50 microns)
"Alt =" Figure 2 "/>
Figure 2. L'expression de lacZ dans des souris transgéniques. Yeux ont été énucléés par dissection et immergé dans 1 mg / ml solution X-gal (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM K4Fe (CN) 6, 2 mM de MgCl2, 0,02% de NP40 , et le désoxycholate de sodium 0,1%) pendant une nuit à 37 ° C. Les yeux étaient fixés dans du glutaraldéhyde formaldehyde/0.2% 2% pendant 30 minutes et en coupe au microtome. X-gal produits (bleu) étiquettes: A. épithélium ciliaire, B. épithélium de la cornée, et C. de la cellule rétinienne ganglion (RGC) couche de la rétine. INL, couche nucléaire interne; ONL, couche nucléaire externe.
Figure 3. Microscopie électronique à transmission de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Après dissection et la création d'une plaie perforante, les yeux étaient fixés par immersion dans du paraformaldéhyde à 2,5% / 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon 0,1 M phosphate de sodium. Les yeux étaient de secondedarily fixé dans textroxide osmium à 1%, peu à peu déshydraté, et noyé dans une résine de Spurr. Tissu a été coupé à 90 nm et placés sur des grilles de cuivre sous couvert de Formvar et imagée à l'aide d'un microscope électronique à transmission. La micrographie montre, segments externes des photorécepteurs de la rétine neurosensorielle, mélanosomes (M) dans l'épithélium pigmentaire de la rétine et la membrane de Bruch.
Figure 4. Marquage immunohistochimique de la superoxyde dismutase-3 (verte) dans le corps vitré de la souris. Yeux ont été énucléés par dissection et a subi une fixation immersion dans du paraformaldéhyde à 4%. Ils ont été inclus dans la paraffine et sectionnés à l'aide d'un microtome. Les coupes de tissu ont été incubées avec un antisérum polyclonal de lapin SOD3 dilué à 1:50. SOD3 expression a été détectée en utilisant un anticorps de chèvre anti-IgG de lapin (H + L)-Alexa Fluor 488 anticorps secondaire conjugué. L'étiquetage des SOD3 est indiqué dans grefr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La plupart des souris transgéniques existent dans les laboratoires qui n'examinent pas les yeux. Notre technique vidéo illustre une méthode simple et standardisé pour le transfert de compétences à distance chirurgicale afin d'optimiser l'acquisition des tissus provenant de laboratoires ayant peu d'expérience avec les yeux. Cette technique aide à surmonter vidéo un écueil majeur dans le phénotypage à haut débit, qui est l'utilisation d'un nombre limité de sites spécialisés en raison de méthodes de collecte de tissus non standardisés et de fixation qui empêchent les études comparatives significatives phénotypiques et moléculaires. D'établir et de maintenir le contrôle qualité avec un nouveau laboratoire à distance et technicien, il est important d'inclure de type sauvage yeux au début et périodiquement tout au long de l'étude. Nous avons également constaté qu'un système de suivi est important quand les yeux de plusieurs de plusieurs génotypes ont été transférés, comme un système basé sur Internet pour attribuer un numéro d'identification unique à chaque oeil. Bien que la fixation de meilleure qualité et des coupes de tissus suivants sont obtenus avecperfusion-fixes animaux, nous constatons que les spécimens d'animaux énucléés non fixées sont suffisants pour la plupart des études morphologiques et moléculaires. Par ailleurs, l'acquisition des yeux des animaux non fixées peuvent être beaucoup plus facile à traiter en haut débit des études provenant de différentes sources. Les souris transgéniques sont un instrument important pour l'étude des maladies ophtalmiques humaine, 10, 11 et à l'acquisition des tissus à distance pour le phénotypage locale tire le meilleur parti de cette précieuse ressource. Application d'une stratégie similaire pour la dissection des tissus et le partage peut avoir un impact important sur le phénotypage à haut débit de la non-ophtalmiques tissus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Research to Prevent Blindness; Bartly J. Mondino MD, directeur de l'Institut Jules Stein Eye, UCLA, et Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui blanc, et Jeanne Estabel à l'Institut Sanger, Wellcome Trust Genome Campus. Cette recherche est conforme à la Déclaration ARVO pour l'utilisation des animaux en ophtalmologie et de la recherche visuelle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
