Summary
טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.
Abstract
עין העכבר היא מודל גנטי חשוב למחקר translational של מחלת עיניים אנושית. מחלות מסנוורות בבני אדם, כגון ניוון מקולרים, ניוון photoreceptor, קטרקט, גלאוקומה, רטינובלסטומה, רטינופתיה סוכרתית וכבר סכם בעכברים מהונדסים. 1-5 עכברים הטרנסגניים ונוקאאוט רוב נוצרו על ידי מעבדות ללמוד מחלות שאינן לרפואת עיניים, אבל שימור גנטי בין מערכות איברים עולה כי רב מאותם הגנים עלולים גם לשחק תפקיד בהתפתחות מחלה ועינית. לפיכך, העכברים האלה מייצגים משאב חשוב לגילוי מתאמים חדשים גנוטיפ-פנוטיפ בעיניים. כי עכברים אלו מפוזרים על פני הגלובוס, קשה לרכוש, לתחזק ופנוטיפ בצורה יעילה וחסכונית. לפיכך, מסכי phenotyping רפואת עיני תפוקה הגבוהה ביותר מוגבלים לכמה מקומות שדורשים באתר, מומחיות העינים לבחון את העיניים בעכברים חיים. 6-9 גישה חלופית שפותחה על ידי המעבדה שלנו היא שיטה לרקמות רכישה מרחוק שניתן להשתמש בו בסקרים גדולים או בקנה מידה הקטן של עיני עכבר מהונדסות. נהלים סטנדרטיים להעברת וידאו מבוסס כירורגית מיומנות, קיבעון רקמות, ומשלוח לאפשר לכל מעבדה כדי לאסוף עיניים שלמות מבעלי חיים מוטנטים ולשלוח אותם לphenotyping מולקולרי ומורפולוגי. במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקות לenucleate ולהעביר עיני עכבר קבועות גם מבולבלות וזלוף לניתוחי phenotyping מרוחקים.
Protocol
1. Dissection הבוטה: enucleation של עין העכבר בדגימות מבולבלות
- לפרק את העפעפיים כדי לשפר את החשיפה וגישה למשטח הגלובוס האחורי (גלגל עין).
- הנח מלקחי הלבשה מעוקלים מאחור (תחת) את כדור הארץ במסלולו (שקע עין). Mahajan Sharptip הלבשת המלקחיים הם מכשיר מותאם אישית עם מחודדים כדי לעשות את הצעד הזה קל יותר (ראה טבלת חומרים וריאגנטים).
- סגור את המלקחיים ותופס את רקמת חיבור מסלולית ועצב אופטי מאחורי העולם בעת היותו זהיר ולהימנע מסחיטת הגלובוס.
- משוך בעדינות את המלקחיים כלפי מעלה וקוטף את גלגל העין ממסלולו. הרקמות הלבנות דמויות חוט היא עצב הראייה.
- הנח את העין בPBS. באמצעות מחט 30-מד, לבצע ניקור יחיד לפצוע מייד אחורי לימבוס ידי הוספת 1-2 מ"מ המחט לתוך גלגל העין. זה מאפשר fixatives, כגון glutaraldehyde, שאחרת לא הצליחו לחדור לרקמות העין, לישירות enter העין. יצירה של פצע זה לא יכול להיות הכרחית אם מקבע, כגון paraformaldehyde או אלכוהול, הוא מסוגל לשדר לרקמות עין של עניין.
- הנח כל העין באופן מיידי למקבע לקיבעון טבילה.
2. Dissection שארפ: enucleation של קיבעון זלוף בא עין העכבר
- השתמש Colibri מלקחיים מעוקלים, כדי להחזיק את העפעף מהעולם.
- מספריים מעוגלים אוריינט Westcott נתיחה מקביל לעולם, תוך חתירה לכיוון חלק האחורי של המסלול.
- חותך את רקמת חיבור הקבועה שמקיפה את הגלובוס מהצדדים הנחותים, המדיאלי, המעולים, ורוחב.
- הנח את המלקחיים המעוקלים מאחורי העולם, אחוז ברקמת החיבור, מבלי ללחוץ על הגלובוס, ולמשוך קדימה כדי enucleate העין. מאז רקמת חיבור מסלולית היא נוקשה מקיבעון זלוף, חיתוך נוסף של רקמות מסלול עשוי להיות נחוץ כדי לשחרר את הגוש לחלוטיןדואר.
3. קיבעון ואריזה
משלוח של רקמות קבועות חייב לעקוב אחר הדרישות המוסדיות ודואר שירותך כולל תוויות ואריזה מתאימות. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה למשלוח דגימה ביולוגית שאינן מדבקת בטמפרטורת הסביבה. זה דורש 3 שכבות של אריזה אבל לא ברמת חומר ביולוגי / B או תוויות של חנקן נוזליות.
- הנח את העין לתוך בקבוקון זכוכית נצנץ 5-מ"ל עם לפחות מקבע 3-מ"ל, או הבולם לאחר מקבע אם הקיבעון הוא קצר. כתוב את מספר המעקב על מכסה מכל ולאטום אותו עם Parafilm.
- בקבוקוני scintillation מקום לדגימה ביולוגית שאושרו מכולה. במכון שלנו, למשל, מכולות שאושרו דורשות שלוש שכבות: מכל אטום שבמדגם ממוקם, שכבה אמצעית סופגת, ושכבה חיצונית ומגנה.
- הנח את המכל לתוך חבילת אריזות בועות ולאחר מכן ליישוםמכל שוטט מעבדת משלוח יחד עם תיעוד מתאים.
4. נציג תוצאות
בדיקה היסטולוגית של עיניים יכולה להתבצע על ידי מגוון שיטות, כולל Hematoxylin ומכתימים Eosin, זיהוי ביטוי האנזימטית מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים, ואימונוהיסטוכימיה. לאחר טבילה בקיבעון paraformaldehyde 4%, רקמה הייתה מוטבעת בפרפין ונותח על microtome. בphenotyping תפוקה גבוהה, אנו מנתחים את סעיפי עצב אופטי תלמיד שהמדגם כל סוגי הרקמות בעין (איור 1). קטעי הרקמה נבדקו גם לביטוי lacZ (איור 2), מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של אברונים סלולריים (איור 3), וביטוי של מולקולות ספציפיות עם נוגדנים (איור 4).
בשיטת הקרנת הפנוטיפ שלנו, זה לא היה חשוב לשמור על נטייה של העין ביחס לאף (canthus מדיאלי) וזמן (lateraצדדים) l canthus. יש לפחות שתי אפשרויות אם נטיית עין היא הכרחית. לאחר enucleation, יש לנו להחיל כוויית אור לקרנית הזמנית במעמד 03:00 עם מכשיר כוויית כף יד. הנגע ברור על היסטולוגיה ואינו הולכות לאיבוד בעיבוד כמו דיו היסטולוגית. החסרון הוא כי ניזקי כווייה בקרנית, אשר עשוי להיות קריטיות לבדיקת רקמות. האפשרות האחרת דורשת אנטומיה מיומנת שיכול לזהות את הוספות שרירי extraocular. תחת stereomicroscope, זיהוי של הכנסת השרירים האלכסוניות מעולה הנחותה ומסמן את ההיבט הנח ומעולה של הגלובוס. 3 עם אף אחת משיטות ההתמצאות, חשוב לעקוב אחר הדגימה כעינו ימנית או שמאלית. יחד, זה יאפשר התמצאות עולם מדויקת לקראת חתך.
איור 1. תמונות היסטולוגית עין עכבר afte מרחוק רכישת r. עיניים מאוסות enucleated ידי נתיחה חדה בעקבות קיבעון זלוף עם paraformaldehyde 4%. סעיף א תלמיד אופטי עצבים מוכתמים בHematoxylin וEosin מראה שימור של כל substructures הרקמות. ON, עצב ראייה. (סרגל קנה מידה ירוק = 500 מיקרון) ב 'מבט גבוה יותר גדלה של הרשתית הנורמלית מראה את המבנה שלה מינרית:, תאי הגנגליון ברשתית RGC;, השכבה פנימית plexiform IPL; שכבת INL, פנימית גרעינית;, השכבה חיצונית plexiform OPL; ONL, חיצוני שכבה גרעינית (תא photoreceptor) (חץ); IS, מגזרי photoreceptor פנימיים (ראש חץ); OS, קטעי photoreceptor חיצוניים; RPE, אפיתל הפיגמנט ברשתית; C, דמה עין. (סרגל קנה מידה ירוק = 50 מיקרון) ג בהשוואה לרשתית הנורמלית, העותק הזה הוא דק יותר בשל התנוונות photoreceptor. ONL, IS, ומערכת ההפעלה נעדרת לחלוטין (חץ). (בר סולם ירוק = 50 מיקרון)
"Alt =" איור 2 "/>
איור 2. ביטוי lacZ בעכברים הטרנסגניים. עיניים היו enucleated ידי נתיחה בוטה ושקוע בפתרון 1 מ"ג / מיליליטר X-גל (5 מ"מ K3Fe (CN) 6, 5 המ"מ K4Fe (CN) 6, 2 מ"מ MgCl2, 0.02% NP40 , ו -0.1% deoxycholate נתרן) לילה בשעת 37 ° C. עיניה היו נעוצות ב2% glutaraldehyde formaldehyde/0.2% במשך 30 דקות ומחולקות בmicrotome. X-Gal מוצרים (כחול) תוויות: א ריסי האפיתל, האפיתל של קרנית ב ', וג גנגליון תא שכבת הרשתית (RGC) ברשתית. INL, שכבה פנימית גרעינית; שכבת ONL, חיצונית גרעינית.
איור 3. מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של אפיתל הפיגמנט ברשתית (רשתית). לאחר נתיחה ויצירה בוטות של פצע, עיניים היו טבילה קבועה בParaformaldehyde 2.5% / 2.5% בGlutaraldehyde חיץ פוספט נתרן 0.1M. עיניים היו seconקבוע darily ב1% textroxide אוסמיום, בהדרגה מיובשת, ומוטבע בשרף של Spurr. הרקמה נותחה ב 90 ננומטר והניחה על גבי רשתות הימורי נחושת המכוסית בFormvar וצלמה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים. מיקרוסקופ תערוכות, מגזרי photoreceptor חיצוניים של הרשתית, נוירו melanosomes (M) בתוך אפיתל הפיגמנט ברשתית, וקרומו של ברוך.
איור 4. תיוג immunohistochemical של dismutase-3 superoxide (ירוק) בזגוגית העכבר. עיניים היו enucleated ידי נתיחה בוטה ועבר קיבוע טבילה בparaformaldehyde 4%. הם גלומים בנפט, ונותח באמצעות microtome. סעיפי רקמות הודגרו עם ארנב SOD3 antiserum polyclonal דילול 1:50. SOD3 ביטוי אובחן באמצעות עיזים נגד ארנב IgG (H + L)-Alexa פלואוריד 488 נוגדנים משניים מצומדות. תיוג של SOD3 מוצג בGREen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עכברים הטרנסגניים ביותר קיימים במעבדות שלא לבחון את העיניים. טכניקת הווידאו שלנו ממחישה שיטה פשוטה, סטנדרטית להעברת מיומנות כירורגית מרחוק כדי לייעל את רכישת רקמה ממעבדות עם ניסיון מועט עם העיניים. טכניקה זו עוזרת להתגבר על וידאו מכשלה עיקרית בphenotyping תפוקה גבוהה, שהוא השימוש במספר מצומצם של אתרי מומחים בשל שיטות איסוף וקיבוע רקמות שאינם סטנדרטי, שמונעות מחקרים פנוטיפי ומולקולריים השוואתיים משמעותיים. כדי להקים ולקיים בקרת איכות בכל מעבדה מרחוק חדשה וטכנאי, חשוב לכלול את עיניים פראיות מסוג בהתחלה ובאופן קבוע במהלך המחקר. בנוסף, מצאו כי מערכת מעקב היא חשובה כאשר עיניים מרובות מגנוטיפים מרובים הועברו, כגון מערכת מבוססת אינטרנט כדי להקצות מספר זיהוי ייחודי לכל עין. למרות קיבעון באיכות גבוהה יותר וחתכי רקמה שלאחר מכן מתקבלים עםזלוף קבועים חיות, אנו מוצאים כי דגימות enucleated מחיות מבולבלות מספיקות למחקרים מורפולוגיים והמולקולריים ביותר. יתר על כן, רכישה של עיניים מחיות מבולבלות עשויה להיות משמעותי יותר קלה לעבד במחקרי תפוקה גבוהה ממקורות שונים. עכברים מהונדסים הם מכשיר חשוב לחקר מחלות אנושיות העינים, 10, 11 ורכישת רקמות מרוחקת phenotyping המקומי עושה את רוב המשאב היקר ערך זה. יישום של אסטרטגיה דומה לנתיחת רקמות ושיתוף עשוי להיות השפעה חשובה על phenotyping תפוקה גבוהה של רקמות שאינה לרפואת עיניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקר כדי למנוע עיוורון; Bartly ג'Mondino MD, מנהל מכון עיני ז'ול שטיין, אוניברסיטת קליפורניה, ורמירו רמירז-סוליס, ג'קי הלבן, וז'אן Estabel במכון סנגר, קמפוס הגנום Wellcome Trust. מחקר זה תואם את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזותי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
