Summary
विच्छेदन तकनीक ऊतक निर्धारण करने के लिए उच्च throughput स्क्रीन में phenotyping प्रदर्शन के लिए माउस आंख की व्याख्या दिखाता है.
Abstract
माउस आंख मानव नेत्र रोग के translational अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण आनुवंशिक मॉडल है. धब्बेदार अध: पतन, फोटोरिसेप्टर अध: पतन, मोतियाबिंद, ग्लूकोमा, retinoblastoma, और मधुमेह रेटिनोपैथी के रूप में मनुष्य में चकाचौंध रोगों ट्रांसजेनिक चूहों में किया गया recapitulated 1-5 हाल ट्रांसजेनिक और पीटा चूहों प्रयोगशालाओं द्वारा उत्पन्न किया गया गैर - नेत्र रोगों का अध्ययन, लेकिन अंग प्रणालियों के बीच आनुवंशिक संरक्षण यह पता चलता है कि एक ही जीन के कई भी आंख का विकास और रोग में एक भूमिका निभा सकते हैं. इसलिए, इन चूहों आंखों में नया जीनोटाइप-phenotype correlations की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन का प्रतिनिधित्व करते हैं. क्योंकि इन चूहों दुनिया भर में फैले हुए हैं, यह मुश्किल है कि अधिग्रहण, को बनाए रखने के लिए, और उन्हें एक कुशल, लागत प्रभावी ढंग में phenotype. इस प्रकार, सबसे उच्च throughput नेत्र phenotyping स्क्रीन कुछ स्थानों है कि साइट पर, नेत्र विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है जीवित चूहों में आंखों की जांच करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं6-9 हमारी प्रयोगशाला द्वारा विकसित एक वैकल्पिक दृष्टिकोण दूरस्थ ऊतक अधिग्रहण है कि ट्रांसजेनिक माउस आँखों के बड़े या छोटे पैमाने पर सर्वेक्षण में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए एक विधि है. वीडियो आधारित शल्य कौशल स्थानांतरण, ऊतक निर्धारण, और शिपिंग के लिए मानकीकृत प्रक्रिया किसी भी प्रयोगशाला उत्परिवर्ती पशुओं से पूरी आँखों को इकट्ठा करने के लिए और आणविक और morphological phenotyping के लिए उन्हें भेज देते हैं. इस वीडियो लेख में, हम को मालूम करना और दूरस्थ phenotyping विश्लेषण के लिए दोनों unfixed और छिड़काव निर्धारित माउस आँखों हस्तांतरण तकनीक मौजूद है.
Protocol
1. ब्लंट विच्छेदन: unfixed नमूनों में माउस आँख की व्याख्या
- अलग जोखिम और पीछे (नेत्रगोलक) दुनिया सतह के लिए उपयोग में सुधार के लिए पलकें खींचो.
- (नीचे) कक्षा में दुनिया भर में (थैली) के पीछे एक घुमावदार ड्रेसिंग forcep रखें. महाजन Sharptip ड्रेसिंग forcep बताया इस कदम को आसान बनाने के लिए (सामग्री और अभिकर्मकों तालिका देखें) के सुझावों के साथ एक कस्टम साधन है.
- Forcep बंद करो और दुनिया के पीछे कक्षीय संयोजी ऊतक और ऑप्टिक तंत्रिका समझ जबकि दुनिया फैलाएंगे से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है.
- धीरे forcep ऊपर की ओर खींचने के लिए और कक्षा से नेत्रगोलक बांधना. धागे की तरह सफेद ऊतक ऑप्टिक तंत्रिका है.
- पीबीएस में नजर रखें. एक 30 गेज सुई का प्रयोग करने के लिए एक एकल पंचर नेत्रगोलक में सुई 1-2 मिमी डालने से तुरंत किनारी के पीछे घाव. यह glutaraldehyde के रूप में इस तरह के fixatives, कि अन्यथा नेत्र ऊतक घुसना करने में असमर्थ हैं सीधे एनआतंकवाद आंख. इस पंचर घाव के निर्माण के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है अगर एक लगानेवाला जैसे paraformaldehyde या शराब के रूप में, ब्याज की नेत्र ऊतकों में diffusing में सक्षम हो सकता है.
- विसर्जन निर्धारण के लिए लगानेवाला में तुरंत पूरे आंखों का रखें.
2. तीव्र विच्छेदन: माउस आँख निम्नलिखित छिड़काव निर्धारण की व्याख्या
- एक घुमावदार COLIBRI forcep प्रयोग पलक दुनिया से दूर रखें.
- ओरिएंट घुमावदार Westcott विच्छेदन दुनिया के समानांतर कैंची, जबकि कक्षा के पीछे की ओर लक्ष्य.
- निश्चित संयोजी ऊतक है कि अवर, औसत दर्जे का, बेहतर है, और पार्श्व पक्षों से दुनिया के चारों ओर काटो.
- दुनिया के पीछे घुमावदार forcep प्लेस, दुनिया पर दबाव के बिना संयोजी ऊतक समझ, और आगे खींचने के लिए आंख मालूम करना. चूंकि कक्षीय संयोजी ऊतक छिड़काव निर्धारण से कड़ी है, कक्षीय ऊतकों के अतिरिक्त काटने के लिए आवश्यक होने के लिए पूरी तरह से glob रिहाई हो सकती हैई.
3. फिक्सेशन और पैकेजिंग
अचल ऊतकों के नौवहन उपयुक्त लेबल और पैकेजिंग सहित अपने संस्थागत और डाक सेवा आवश्यकताओं का पालन करना चाहिए. निम्नलिखित प्रोटोकॉल परिवेश के तापमान पर एक गैर संक्रामक जैविक नमूने शिपिंग का एक उदाहरण है. यह पैकेजिंग के 3 परतें लेकिन कोई वर्ग ए / बी जैविक पदार्थ या तरल नाइट्रोजन लेबल की आवश्यकता है.
- एक गिलास 5 एमएल जगमगाहट शीशी में कम से कम लगानेवाला 3 एमएल, या के बाद लगानेवाला बफर के साथ आंख जगह अगर निर्धारण कम है. शीशी के ढक्कन पर ट्रैकिंग नंबर लिखें और यह Parafilm साथ सील.
- जगह एक जैविक नमूने में जगमगाहट शीशियों कंटेनर शिपिंग को मंजूरी दे दी. एक मोहरबंद कंटेनर में जो नमूना रखा गया है, एक शोषक मध्यम परत है, और एक सुरक्षात्मक बाहरी परत: हमारे संस्थान में, उदाहरण के लिए मंजूरी दे दी, कंटेनर तीन परतों की आवश्यकता होती है.
- एक बुलबुला लपेटो पैकेज में और फिर एक अनुप्रयोग में कंटेनर रखेंroved प्रयोगशाला शिपिंग कंटेनर उचित दस्तावेज के साथ.
4. प्रतिनिधि परिणाम
आँखों के histological परीक्षा Hematoxylin और लाल भामसान रंग धुंधला हो जाना, enzymatic अभिव्यक्ति का पता लगाने, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और immunohistochemistry सहित तरीकों की एक किस्म के द्वारा किया जा सकता है. 4% paraformaldehyde में विसर्जन के निर्धारण के बाद, ऊतक आयल और एक सूक्ष्म तक्षणी पर sectioned में एम्बेडेड था. उच्च throughput phenotyping में, हम शिष्य ऑप्टिक तंत्रिका वर्गों का विश्लेषण है कि नमूना आंखों में सभी प्रकार के ऊतक (1 चित्रा). ऊतक की धारा भी lacZ अभिव्यक्ति (2 चित्रा), संचरण सेलुलर organelles इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (3 चित्रा), और एंटीबॉडी (4 चित्रा) के साथ विशिष्ट अणुओं की अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई.
हमारे phenotype स्क्रीनिंग पद्धति में, यह महत्वपूर्ण नाक के संबंध में (औसत दर्जे का नेत्रकोण) और लौकिक के साथ आंख के उन्मुखीकरण को बनाए रखने (lateraएल नेत्रकोण) पक्षों. वहाँ कम से कम दो विकल्प हैं अगर आंख उन्मुखीकरण के लिए आवश्यक है. स्पष्टीकरण के बाद, हम तीन एक हाथ में प्रदाहान डिवाइस के साथ एक बजे की स्थिति पर प्रकाश दाग़ना अस्थायी कॉर्निया को लागू किया है. घाव ऊतक विज्ञान पर स्पष्ट करता है और histological स्याही की तरह प्रसंस्करण के दौरान खो नहीं मिलता. नकारात्मक पक्ष यह है कि दाग़ना कॉर्निया, जो परीक्षा के लिए एक महत्वपूर्ण ऊतकों को हो सकता है नुकसान. दूसरे विकल्प के एक कुशल anatomist कि extraocular मांसपेशियों सम्मिलन की पहचान कर सकते हैं की आवश्यकता है. एक stereomicroscope के तहत अवर और बेहतर तिरछा मांसपेशी प्रविष्टि की पहचान या तो अभिविन्यास विधि के साथ दुनिया के अवर और बेहतर और पहलू है. 3 के निशान है, यह महत्वपूर्ण है एक सही या बाईं आंख के रूप में नमूना ट्रैक. साथ में, इस सेक्शनिंग के लिए सटीक अभिविन्यास दुनिया पहले की अनुमति देगा.
चित्रा 1. माउस आंख histological छवियों afte r दूरस्थ अधिग्रहण. माउस आँखें तेज विच्छेदन 4% paraformaldehyde साथ छिड़काव निर्धारण के बाद enucleated ए छात्र - ऑप्टिक तंत्रिका Hematoxylin और लाल भामसान रंग के साथ दाग अनुभाग सभी ऊतक substructures के संरक्षण से पता चलता है. पर, ऑप्टिक तंत्रिका. , आईपीएल, भीतरी उलझन - रूप परत, लीग, भीतर परमाणु परत; OPL, बाहरी उलझन - रूप परत; ONL बाहरी, RGC, रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (हरी पैमाने बार = 500 microns) बी एक सामान्य रेटिना के उच्च बढ़ाई दृश्य अपने लामिना संरचना से पता चलता है परमाणु परत (फोटोरिसेप्टर सेल) (तीर); है, फोटोरिसेप्टर भीतरी खंडों (तीर सिर), ओएस, बाहरी फोटोरिसेप्टर घटकों; RPE, रेटिना वर्णक उपकला, सी, रंजित. सी. (हरी पैमाने बार = 50 microns) सामान्य रेटिना की तुलना में, इस नमूना पतली फोटोरिसेप्टर अध: पतन की वजह से है. ONL है, और ओएस पूरी तरह से अनुपस्थित (तीर) कर रहे हैं. (ग्रीन पैमाने बार = 50 microns)
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चित्रा 2 ट्रांसजेनिक चूहों में lacZ अभिव्यक्ति आंखें कुंद विच्छेदन द्वारा enucleated गया और 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान एक्स - लड़की में डूबे (5 मिमी K3Fe (CN) 6, 5 मिमी K4Fe (CN) 6, 2 मिमी MgCl2, 0.02 NP40% , और 0.1% सोडियम) 37 पर रातोंरात deoxycholate डिग्री सेल्सियस आंखें 2% 30 मिनट और एक सूक्ष्म तक्षणी पर sectioned लिए formaldehyde/0.2% glutaraldehyde में तय किया गया. रोमक उपकला ए, बी corneal उपकला, और सी. रेटिना रेटिना में नाड़ीग्रन्थि सेल परत (RGC): एक्स - लड़की उत्पाद (नीला) लेबल. लीग, भीतर परमाणु परत, ONL, बाहरी परमाणु परत.
चित्रा 3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी रेटिना वर्णक उपकला (RPE) की कुंद और एक पंचर घाव के विच्छेदन के निर्माण के बाद, आंखों विसर्जन थे. 2.5% / 0.1M सोडियम फॉस्फेट बफर में 2.5% glutaraldehyde Paraformaldehyde में तय की. आंखें secon थेdarily 1% आज़मियम textroxide में तय है, धीरे - धीरे निर्जलित, और Spurr राल में एम्बेडेड. 90 एनएम में ऊतक sectioned था और तांबे स्लॉट Formvar में कवर ग्रिड पर रखा और एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged. माइक्रोग्राफ से पता चलता है, neurosensory रेटिना के फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों, रेटिना वर्णक उपकला भीतर melanosomes (एम), और Bruch झिल्ली.
चित्रा 4. Superoxide dismutase-3 के immunohistochemical लेबलिंग (हरा) माउस कांच का आंखें. कुंद विच्छेदन द्वारा enucleated थे और 4% paraformaldehyde में विसर्जन निर्धारण लिया. वे आयल और sectioned एक सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग में एम्बेडेड थे. 1:50 पतला ऊतक वर्गों खरगोश पॉलीक्लोनल SOD3 सीरमरोधी साथ incubated रहे थे. अभिव्यक्ति SOD3 एक बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच एल +) एलेक्सा Fluor 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए पाया गया था. SOD3 की लेबलिंग gre में दिखाया गया हैएन.
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Discussion
हाल ट्रांसजेनिक चूहों प्रयोगशालाओं में मौजूद है कि आँखों की जांच नहीं. हमारे वीडियो तकनीक दूरस्थ शल्य कौशल आँखों के साथ थोड़ा अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं से ऊतक अधिग्रहण का अनुकूलन हस्तांतरण के लिए एक सरल, मानकीकृत विधि दिखाता है. इस वीडियो तकनीक में मदद करता है उच्च throughput phenotyping, जो विशेषज्ञ गैर मानकीकृत ऊतक संग्रह और निर्धारण तरीकों कि सार्थक तुलनात्मक प्ररूपी पढ़ाई आणविक और को रोकने के कारण साइटों की एक सीमित संख्या में उपयोग में एक प्रमुख ख़तरा पर काबू पाने के. स्थापित करने के लिए और किसी भी नए दूरस्थ प्रयोगशाला और तकनीशियन के साथ गुणवत्ता नियंत्रण बनाए रखने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि अध्ययन के दौरान शुरू में है और समय - समय पर जंगली प्रकार आँखें शामिल है. हम यह भी पाया कि एक ट्रैकिंग प्रणाली महत्वपूर्ण है जब कई जीनोटाइप से कई आंखों, एक वेब आधारित प्रणाली के रूप में प्रत्येक आंख के लिए एक अद्वितीय पहचान संख्या आवंटित स्थानांतरित कर दिया गया है. हालांकि उच्च गुणवत्ता निर्धारण और बाद में ऊतक वर्गों के साथ प्राप्त कर रहे हैंछिड़काव तय जानवरों, हम पाते हैं कि unfixed जानवरों से enucleated नमूनों सबसे morphological और आणविक अध्ययन के लिए पर्याप्त हैं. इसके अलावा, unfixed जानवरों से आँखों के अधिग्रहण काफी विभिन्न स्रोतों से उच्च throughput अध्ययन में कार्रवाई करने के लिए आसान हो सकता है. ट्रांसजेनिक चूहों मानव नेत्र रोग, 10, 11 और दूरदराज के ऊतक अधिग्रहण की जांच के लिए स्थानीय phenotyping इस बहुमूल्य संसाधन के सबसे अधिक करता है के लिए एक महत्वपूर्ण साधन हैं. ऊतक विच्छेदन और साझा करने के लिए इसी तरह की रणनीति के आवेदन उच्च throughput गैर नेत्र ऊतकों के phenotyping पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
दिया Bartly जे Mondino एमडी, जूल्स Stein नेत्र संस्थान, UCLA के निदेशक, और रेमिरो Ramirez Solis, Jacqui व्हाइट, और Jeanne Estabel सेंगर इंस्टीट्यूट, वेलकम ट्रस्ट जीनोम कैम्पस में अंधापन को रोकने के रिसर्च. इस शोध नेत्र और दृश्य अनुसंधान में जानवरों के इस्तेमाल के लिए ARVO वक्तव्य के साथ अनुपालन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
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