Summary
解剖手法は、ハイスループットスクリーニングで表現型解析を実行するための組織固定のマウス眼球摘出を示しています。
Abstract
マウスの眼は人間の眼疾患のトランスレーショナル研究のための重要な遺伝的モデルです。このような黄斑変性、光受容体の変性、白内障、緑内障、網膜芽細胞腫、および糖尿病性網膜症などのヒトでのまばゆいばかりの病気、トランスジェニックマウスで再現されています1月5日ほとんどのトランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスは非眼疾患を研究する研究室で生成されましたが、器官系の間の遺伝的保全が同じ遺伝子の多くはまた、眼の発達と疾患における役割を果たしている可能性を示唆している。したがって、これらのマウスは、眼の中に新たな遺伝子型と表現型の相関を発見するための重要なリソースを表します。これらのマウスは世界中に散らばっているので、それは、獲得、維持、効率的で費用対効果の高い方法で表現型、それらをすることは困難である。従って、最も高スループットの眼科表現型画面は生きたマウスで目を調べるために、眼科の専門知識を現場で必要とするいくつかの場所に制限されています6-9は、当研究室が開発した代替アプローチは、トランスジェニックマウスの目の大規模または小規模な調査で使用することができるリモート組織獲得するための方法である。ビデオベースの手術技能移転、組織の固定、出荷のために標準化された手順は、どの研究室では変異動物から全体の目を収集し、分子と形態学的表現型解析のためにそれらを送信することができます。このビデオの記事では、我々は、リモート表現型解析に固定されていないと血流の両方の固定マウスの目を摘出すると、転送する手法を提案する。
Protocol
1。鈍的切開：未固定標本でマウス眼球摘出
- 後部地球儀（眼球）表面への曝露とのアクセスを改善するためにまぶたを引き離す。
- 軌道上の（下）地球儀（眼窩）の背後にある湾曲したドレッシング鉗子を置きます。マハジャンSharptipドレッシング鉗子は、（材料および試薬の表を参照）、この手順を容易にするために、先の尖った先端を持つカスタムインストゥルメントです。
- 鉗子を閉じて、地球儀を圧迫しないように注意しながら、地球の背後にある軌道結合組織や視神経を把握する。
- ゆっくり上向きに鉗子を引くと軌道から眼球を摘み取る。白い糸状の組織が視神経です。
- PBSに目を置きます。 30ゲージの針を使用して、単一の穿刺は、眼球に針1〜2ミリメートルを挿入することにより、角膜輪部のすぐ後方に巻きつけてください。これは、眼組織に浸透することができませんそうでなければ、グルタルアルデヒドなどの固定剤は、、、エン直接することができますTER目。固定剤、例えばパラホルムアルデヒドやアルコールなど、関心の眼組織内に拡散することが可能である場合は、この刺し傷の作成は必要でないかもしれません。
- 直ちに浸固定用固定液に全体の目を置きます。
2。シャープ解剖：灌流固定後に、マウスの眼球摘出
- 離れて地球からまぶたを保持するために湾曲したコリブリ鉗子を使用しています。
- 地球に平行オリエント湾曲したウェストコット郭清をはさみ、軌道の背面方向を目指しながら。
- 劣った、内側、優れており、側面から地球を囲む固定結合組織を切り取ります。
- 地球の後ろに湾曲した鉗子を置き、世界中で押さずに結合組織をつかみ、目を摘出するために前方に引き出します。軌道の結合組織は、灌流固定から硬いですので、軌道組織のさらなる切断は完全にglobを解放する必要があるかもしれません電子。
3。固定およびパッケージング
固定組織の送料は、適切なラベルや包装も含めて制度や郵便サービス要件に従わなければなりません。次のプロトコルは、周囲温度で非感染性の生物学的サンプルを出荷した例です。これは、3包装の層が、ないクラスA / Bの生物学的物質または液体窒素ラベルを必要とします。
- 固定が短い場合、少なくとも3 mLの固定、またはポスト固定緩衝液で5 mLのガラス製シンチレーションバイアルに目を置きます。瓶の蓋の上に追跡番号を書いて、パラフィルムでそれを封印。
- 生体試料中に置き、シンチレーションバイアルは、輸送用コンテナを承認した。サンプルが置かれている密封容器、吸収中間層、および保護外層：当研究所では、例えば、認定された容器は、3つの層を必要とします。
- バブルラップのパッケージにしてからアプリに容器を置きます適切なマニュアルと一緒に実験室の輸送用コンテナをroved。
4。代表的な結果
目の組織学的検査をヘマトキシリンおよびエオシン染色、酵素発現の検出、透過型電子顕微鏡、免疫組織化学を含む様々な方法により行うことができる。 4％パラホルムアルデヒド中で浸漬固定後、組織をミクロトームでパラフィン切片に埋め込まれていました。ハイスループット表現型では、瞳孔視神経節を分析し、その目の中のサンプルのすべての種類の組織（図1）。組織の切片もlacZ発現（図2）、細胞小器官の透過型電子顕微鏡（図3）、および抗体（図4）を持つ特定の分子の発現を調べた。
私たちの表現型スクリーニング方法では、（内側眼角）鼻と時間的（lateraに関して目の向きを維持することが重要ではありませんでしたリットル眼角）の側面。眼の向きが必要な場合は、少なくとも2つのオプションがあります。摘出した後、我々はハンドヘルド焼灼装置と3時の位置に一時的な角膜に光焼灼を適用している。病変は組織学的に明らかであり、組織学的にインクのような処理中に迷子になることはありません。欠点は、焼灼損害賠償審査のための重要な組織かもしれない角膜です。他のオプションは、外眼筋の挿入を識別することができる熟練した解剖学者を必要とします。どちら向きの方法で3劣ると上斜筋の挿入の識別が劣ると優れた、地球の側面にマークを付けます。実体顕微鏡下では、右または左眼等の標本を追跡することが重要です。一緒に、これは切断前に正確な地球のオリエンテーションを許容するでしょう。
図1。マウス眼組織学的画像はafte Rリモート買収。マウスの目が4％パラホルムアルデヒドで灌流固定後に鋭い切開により摘出した。ヘマトキシリンとエオシンで染色Aの瞳孔視神経節では、すべての組織の下部構造の保全を示しています。視神経は、ON。 、IPL、内網状層、INLは、内顆粒層、OPL、外網状層、ONL、アウターRGC、網膜神経節細胞：正常な網膜の（緑のスケールバー= 500ミクロン）B.高倍率のビューには、層状構造を示しています核層（光受容細胞）（矢印）は、OS、感光体外側セグメント;、RPE、網膜色素上皮、C、脈絡膜、感光体の内側セグメント（矢頭）です。 （緑のスケールバー= 50ミクロン） では、通常の網膜に比べて、この試料は光受容体の変性にシンナーが原因です。 ONL、IS、およびOS（矢印）は完全に欠けている。 （緑のスケールバー= 50ミクロン）
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トランスジェニックマウスにおける図2 lacZ発現。目は（5mMのK3Fe（CN）6、5mMのK4Fe（CN）6、2 mMのMgCl2、0.02％NP40鈍的切開により摘出し、1 mg / mlのX-gal溶液に浸漬した、0.1％デオキシコール酸ナトリウム）を37℃で一晩目は30分、ミクロトームで切片は2％formaldehyde/0.2％グルタルアルデヒドで固定した。 X-galを積（青）ラベル：A.繊毛上皮、角膜上皮B.とC.網膜の網膜神経節細胞（RGC）層。 INLは、内顆粒層、ONL、外核層。
図3。網膜色素上皮（RPE）の透過型電子顕微鏡。刺し傷の鈍的切開および作成した後、目が浸いたが0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中の2.5％ホルムアルデヒド/ 2.5％グルタルアルデヒドで固定した。目はseconのあったdarily徐々に脱水し、1％オスミウムtextroxideで固定し、スパーの樹脂に包埋した。組織は90 nmであった切片とFormvarで覆われた銅スロットグリッド上に配置し、透過型電子顕微鏡を用いて撮像。顕微鏡写真は、感光体外側の神経感覚網膜のセグメントは、網膜色素上皮内メラノソーム（M）とブルッフ膜を示しています。
図4。マウスの硝子体中のスーパーオキシドジスムターゼ-3の免疫組織化学的標識（緑）。目は鈍的切開により摘出し、4％パラホルムアルデヒド中で浸漬固定を施行した。彼らは、ミクロトームを用いてパラフィン切片中に包埋した。組織切片を1:50に希釈したウサギポリクローナルSOD3抗血清とともにインキュベートした。 SOD3式はヤギ抗ウサギIgG（H + L）のAlexa Fluor 488標識二次抗体を用いて検出した。 SOD3の標識は、GREに示されている専用。
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Discussion
ほとんどのトランスジェニックマウスは、目を検査しません研究室に存在します。私たちのビデオ技術は目で少し経験を持つ研究室から組織の取り込みを最適化するために、遠隔手術技能移転のためのシンプルな、標準化された方法を示しています。この映像技術は、意味のある比較の表現型および分子生物学的研究を防止する非標準化組織採取と固定方法に起因専門サイトの限られた数の使用であるハイスループット表現型、の主要な落とし穴を克服するのに役立ちます。任意の新しいリモートラボと担当者と一緒に品質管理を確立し、維持するためには、開始時及び定期的に試験期間を通じて、野生型の目を含めることが重要です。また、複数の遺伝子から複数の目はそのようなそれぞれの目に一意の識別番号を割り当てるには、Webベースのシステムのように、転送されたときに追跡システムが重要であることがわかった。より高品質の固定およびその後の組織切片を用いて得られていますが灌流固定した動物は、我々は固定されていない動物から摘出標本はほとんどの形態学的および分子生物学的研究のために十分であることがわかる。また、固定されていない動物から目の買収は、異なるソースからのハイスループット研究で処理するために大幅に容易になることがあります。トランスジェニックマウスでは、地元の表現型は、この貴重な資源を最大限に活用するため、人間の眼疾患、10、11、リモート組織の買収を調べるための重要な手段である。組織切開と共有のための同様の戦略のアプリケーションは非眼組織のハイスループット表現型解析に重要な影響を与える可能性があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
失明を防ぐための研究、サンガー研究所、ウェルカムトラストゲノムキャンパスでとラミロ·ラミレス·ソリス、ジャッキーホワイト、ジャンヌEstabel; Bartly J·モンディーノMDは、ジュール·スタイン眼研究所、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）のディレクター。この研究は、眼科とビジュアルリサーチにおける動物の使用に関するARVOステートメントに準拠しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
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