Summary
분해 기술은 높은 처리량 화면에서 phenotyping을 수행 할 조직 고정에 대한 마우스 눈의 핵의 제거를 보여줍니다.
Abstract
마우스 눈은 인간의 안과 질환의 병진 연구의 중요한 유전 모델입니다. 이러한 황반 변성, photoreceptor 변성, 백내장, 녹내장, retinoblastoma, 그리고 당뇨병 성 망막증과 같은 인간에 실명을 야기하는 안구 질환을 치료는 1-5 대부분의 유전자 변형과 녹아웃 마우스가 아닌 안과 질환을 연구하기 위해 실험실에 의해 생성되었습니다. 유전자 변형 마우스에 recapitulated하지만, 한 장기 시스템 사이의 유전 절약은 동일한 유전자의 많은도 안구 개발과 질병에 역할을 할 수 있습니다 제안합니다. 따라서,이 마우스는 눈에 새로운 유전자형 - 표현형의 상관 관계를 발견하기위한 중요한 자원을 나타냅니다. 이 마우스는 전 세계에 흩어져 있기 때문에, 취득, 유지 관리 및 효율적 비용 효율적인 방법으로 표현형을하기가 어렵습니다. 따라서, 대부분의 높은 처리량 안과 phenotyping 화면은 라이브 쥐에 눈을 검토하기 위해 안과 전문 현장에서 필요로 몇 가지 위치로 제한됩니다. 6-9는 우리 연구실에서 개발 한 대체 접근 방식은 유전자 변형 마우스 눈 크고 작은 규모의 설문 조사에서 사용할 수있는 원격 조직 - 취득하는 방법입니다. 비디오 기반의 수술 기술 이전, 조직 고정 및 배송을위한 표준화 된 절차는 실험실 돌연변이 동물로부터 전체 눈을 수집하고 분자 및 형태학 phenotyping에 보내 할 수 있습니다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 원격 phenotyping 분석을 위해 떼어 낸 및 재관류 모두 고정 마우스 눈을 명백히하다하고 전송하는 기술을 제시한다.
Protocol
1. 무딘 절개 : 고정되지 않은 표본에서 마우스 눈의 핵의 제거
- 노출과 뒤쪽 세계 (안구) 표면에 대한 액세스를 개선하기 위해 눈꺼풀를 분열.
- 궤도의 (이하) 세계 (눈 소켓) 뒤에 곡선 드레스 forcep를 놓습니다. Mahajan Sharptip 드레싱 forcep은 (재료 및 시약 표 참조)이 단계를 쉽게하기 위해 뾰족한 팁을 사용자 정의 악기입니다.
- forcep을 닫고 세계를 쥐어 피하려면 조심하면서 전 세계 뒤에 궤도 결합 조직과 시신경을 파악.
- 부드럽게 위쪽으로 forcep을 뽑아 궤도에서 눈알을 뽑아 내다. 흰색 스레드와 같은 조직은 시신경입니다.
- PBS의 눈을 놓으십시오. 30 게이지 바늘을 사용하여, 하나의 구멍이 안구에 바늘 1~2밀리미터를 삽입하여 limbus에 바로 뒤쪽 상처를합니다. 이 안구 조직을 침투하기가 달리없는 등 글 루타 알데히드 등의 fixatives는,,, 실내 직접 수행 할 수 있습니다적이있는 눈. 이 정착액 등 paraformaldehyde 또는 알코올 등, 관심 안구 조직에 diffusing 할 경우이 찔린 상처를 만들 필요하지 않을 수 있습니다.
- 즉시 침지 고정 용 정착액으로 전체 눈을 놓습니다.
2. 샤프 해부 : 마우스 눈 다음 재관류 고정의 핵의 제거
- 거리에 세계에서 눈꺼풀을 보유하는 곡선 colibri forcep을 사용합니다.
- 전 세계에 평행 동양 곡선 Westcott의 분해 가위, 궤도의 뒷면을 향해 목표로하는 동안.
- 하부, 중간, 우수한, 그리고 측면 측면에서 세계를 둘러싸고있는 고정 결합 조직을 잘라.
- 세계 뒤에 곡선 forcep을 놓고 세계에 눌러없이 결합 조직을 파악하고, 눈을 명백히하다 앞으로 당긴다. 궤도 결합 조직은 관류 고정에서 치열한이기 때문에, 궤도 조직의 추가 절단 완전히 글로브를 공개 할 필요가있을 수 있습니다5.
3. 고정 및 패키징
고정 조직의 배송은 적절한 라벨 및 포장을 포함하여 기관 및 우편 서비스 요구 사항을 준수해야합니다. 다음 프로토콜은 주위 온도에서 비 전염성 생물 샘플을 출하의 예입니다. 이 3 포장 층 있지만 클래스 A / B 생물학적 물질 또는 액체 질소 라벨이 필요합니다.
- 고정 짧은 경우 최소 3-ML의 정착액, 포스트 정착액 버퍼로 5 ML 유리 섬광 유리 병에 눈을 넣습니다. 유리 병의 뚜껑에있는 추적 번호를 작성하고 Parafilm로 밀봉.
- 생물학적 샘플로 장소 섬광 튜브는 배송 컨테이너를 승인했습니다. 샘플이 배치되는 밀폐 용기, 흡수 중간 계층 및 보호 외부 층 : 우리 연구소에서 예를 들어, 승인 컨테이너는 3 층이 필요합니다.
- 버블 랩 패키지로 한 다음 응용 프로그램에 컨테이너를 놓고적절한 서류와 함께 roved 실험실 배송 컨테이너.
4. 대표 결과
눈의 조직 학적 시험은 Hematoxylin과 Eosin의 착색, 효소 표현 감지, 전송 전자 현미경, 그리고 immunohistochemistry 등의 다양한 방법으로 수행 할 수 있습니다. 4 % paraformaldehyde에 침적 고정 후, 조직은 파라핀과 마이크로톰에 sectioned에 포함되었다. 높은 처리량 phenotyping, 우리는 학생 - 시신경 부분을 분석이 눈에 샘플 모든 조직 유형 (그림 1). 조직의 제는 lacZ 표현 (그림 2), 세포 세포 소기관의 전송 전자 현미경 (그림 3) 및 항체 (그림 4)와 특정 분자의 표현을 검토했다.
우리의 표현형 검사 방법에서는 (latera 코에 대해 (중간 안각)과 측두엽과 눈의 방향을 유지하기 위해 중요하지리터 안각)면. 눈의 방향이 필요한 경우 최소한 두 가지 옵션이 있습니다. 핵의 제거 후, 우리는 휴대용 소작 장치와 세시 위치에 시간적 각막에 빛 소작을 적용했습니다. 병변은 조직 학적 소견에 분명하고 조직 학적 잉크와 같은 처리하는 동안 손실되지 않습니다. 단점은 그 소작 손해 시험을위한 중요한 조직이 될 수있는 각막이다. 다른 옵션은 extraocular 근육 삽입을 식별 할 수있는 숙련 된 해부학자가 필요합니다. stereomicroscope에서 하부 우수한 경사 근육 삽입의 식별이 세계의 하부 및 뛰어난 및 측면을 표시합니다. 3 중 오리엔테이션 방법으로는 오른쪽 또는 왼쪽 눈으로 표본을 추적하는 것이 중요합니다. 함께이 sectioning하기 전에 정확한 전 방향을 할 수 있습니다.
1 그림. 마우스 눈 조직 학적 이미지는 afte R 원격 획득. 마우스 눈은 4 % paraformaldehyde로 관류 고정 후 날카로운 절개로 enucleated했다. Hematoxylin과 Eosin 물들 A.의 학생 - 시신경이 섹션은 모든 조직 substructures의 보존을 보여줍니다. 시신경이 없으면, ON. , IPL, 내부 plexiform 레이어, INL, 내부 핵 계층, OPL, 외부 plexiform 레이어, ONL, 외부 RGC, 망막 신경절 세포 : 일반 망막의 (녹색 규모의 바 = 500 마이크론) B. 높은 배율의 전망은 판상 구조를 보여줍니다 핵 레이어 (photoreceptor 세포) (화살표), OS, photoreceptor 외부 세그먼트; RPE, 망막 안료 상피, C, 맥락막, photoreceptor 내부 세그먼트 (화살표 머리)입니다. (녹색 규모 바 = 50 마이크론) C.는 정상적인 망막에 비해,이 표본은 photoreceptor 변성에 얇은 때문입니다. ONL는 있으며, OS는 (화살표) 완전히 결석입니다. (녹색 규모 줄이 = 50 마이크론)
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유전자 변형 쥐 그림 2. lacZ의 표현. 눈 (5 MM K3Fe (CN) 6, 5 MM K4Fe (CN) 6, 2 MM MgCl2, 0.02 % NP40 무딘 절개로 enucleated 1 MG / ML X-여자 솔루션에 몰두했다 37의 밤 및 0.1 % 나트륨 deoxycholate) ° C. 눈은 30 분 마이크로톰에 sectioned 2 % formaldehyde/0.2 %의 글 루타 알데히드에서 수정되었습니다. X-여자 제품 (파란색) 레이블 : A. Ciliary 상피, B. 각막 상피와 C. 망막의 망막 신경절 세포 (RGC) 계층. INL, 내부 핵 계층, ONL, 바깥 쪽 핵 층.
그림 3. 망막 색소 상피 (RPE)의 전송 전자 현미경. 찔린 상처의 무딘 절개과 창조 후, 눈을 집중했다는 0.1M 나트륨 인산염 버퍼에 2.5 %의 Paraformaldehyde / 2.5 %의 글 루타 알데히드에 고정. 눈이 secon했다darily, 1 % 오스뮴의 textroxide에서 수정 서서히 건조하고, Spurr의 수지에 포함. 조직은 90 나노 미터에서 sectioned이고 Formvar로 덮여 구리 슬롯 격자에 배치하고 전송 전자 현미경을 사용하여 이미징. 현미경은 photoreceptor 외부 neurosensory 망막의 세그먼트, 망막 안료 상피 내 melanosomes (M), 그리고 Bruch의 멤브레인을 보여줍니다.
4 그림. 마우스 유리체에서 초과 산화물 dismutase-3 Immunohistochemical 라벨 (녹색). 눈이 무딘 절개로 enucleated와 4 % paraformaldehyde에 침적 고정을 받았습니다되었습니다. 그들은 마이크로톰을 사용하여 파라핀과 sectioned에 포함되었습니다. 1시 50분을 희석 조직 섹션은 토끼 polyclonal SOD3 항혈청과 incubated되었습니다. SOD3 표현은 염소 안티 - 토끼 IgG (H + L) - 알렉사 형석 488 복합 차 항체를 사용하여 감지되었습니다. SOD3의 라벨은 GRE에 표시됩니다ko 페이지를 참조하십시오.
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Discussion
대부분의 유전자 변형 마우스는 눈을 검사하지 않는 실험실에 존재합니다. 우리 비디오 기술은 눈 작은 경험이있는 실험실에서 조직 획득을 최적화 할 수 원격 수술 기술 이전을위한 간단한 표준화 된 방법을 보여줍니다. 이 비디오 기술은 의미있는 비교 phenotypic와 분자 연구를 방지 비 표준화 조직 수집 및 고정 방법에 의한 전문 사이트 제한된 수의를 사용하는 것입니다 높은 처리량 phenotyping에 주요 함정을 극복하는 데 도움이됩니다. 새로운 원격 실험실과 기술자와 품질 관리를 설정하고 유지하기 위해, 그것은 시작과 정기적으로 연구를 통해 야생 형 눈을 포함하는 것이 중요합니다. 우리는 또한 여러 genotypes에서 여러 눈 등 각각의 눈에 고유 한 식별 번호를 할당 할 수있는 웹 기반 시스템으로, 전송 때 추적 시스템이 중요하다는 것을 발견했다. 높은 수준의 고정 및 후속 조직 섹션을 얻을 수 있지만재관류 - 고정 동물, 우리는 고정되지 않은 동물로부터 enucleated 표본은 대부분의 형태학 및 분자 연구를위한 충분한 것을 찾을 수 있습니다. 또한, 고정되지 않은 동물의 눈의 취득은 다른 소스에서 높은 처리량 연구에서 처리 할 수 상당히 쉽게 할 수 있습니다. 유전자 변형 마우스는 지역 phenotyping이 귀중한 자원의 대부분을 만드는에 대한 인간의 안과 질환, 10, 11 및 원격 조직 획득을 조사하기위한 중요한 악기입니다. 조직 절개 및 공유를위한 비슷한 전략의 응용 프로그램이 아닌 안과 조직의 높은 처리량 phenotyping에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
Bartly J. Mondino MD, 줄스 스타 인 안구 연구소, UCLA의 이사;, 그리고 라미 네즈 - 솔리스, 재키 선배 화이트와 Sanger 연구소, 웰컴 트러스트 게놈 캠퍼스에서 쟌 Estabel 실명 방지를위한 연구. 이 연구는 안과 및 Visual 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 보호 정책을 준수합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
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