Summary
A técnica de dissecção ilustra enucleação do olho do rato para fixação do tecido para realizar fenotipagem em alto rendimento telas.
Abstract
O olho do rato é um modelo genético importante para o estudo da doença de translação oftálmica humana. Doenças que causam cegueira em humanos, tais como a degeneração macular, a degeneração de fotorreceptores, cataratas, glaucoma, retinoblastoma, e retinopatia diabética foram recapitulado em ratinhos transgénicos. 1-5 ratinhos transgénicos e knockout maioria foram gerados por laboratórios para estudar doenças não oftálmicas, mas conservação genética entre os sistemas de órgãos sugere que muitos dos mesmos genes podem também desempenhar um papel no desenvolvimento ocular e doenças. Assim, estes ratos representam um recurso importante para a descoberta de novas correlações genótipo-fenótipo no olho. Porque esses ratos estão espalhados por todo o mundo, é difícil de adquirir, manter e fenótipo-los de forma eficiente, boa relação custo-benefício. Assim, a maioria de alto rendimento telas fenotipagem oftálmicas são restritos a alguns locais que necessitam no local, a perícia oftalmológica para examinar os olhos em camundongos vivos. 6-9 Uma abordagem alternativa desenvolvida pelo nosso laboratório é um método para o controle remoto de aquisição tecido que pode ser utilizado em estudos de grandes dimensões ou de pequena escala de olhos de ratinhos transgénicos. Procedimentos padronizados para vídeo baseado em transferência de habilidade cirúrgica, fixação do tecido, e transporte permitem que qualquer laboratório para coletar olhos inteiros de animais mutantes e enviá-las para fenotipagem molecular e morfológica. Neste artigo de vídeo, nós apresentamos técnicas para enuclear e transferir ambos não corrigidos e perfusão olhos de rato fixos para análises fenotípicas remotos.
Protocol
1. Dissecção Blunt: Enucleação do olho do rato em amostras não corrigidos
- Separar as pálpebras para melhorar a exposição e o acesso ao mundo posterior (globo ocular) de superfície.
- Coloque uma pinça de vestir curva por trás (abaixo) o globo na órbita (órbita). O Mahajan Sharptip vestir fórceps é um instrumento personalizado com pontas para facilitar essa etapa (ver materiais e reagentes de mesa).
- Feche a pinça e captar o tecido conjuntivo orbital e nervo óptico atrás do globo, tendo o cuidado para evitar apertar o globo.
- Com cuidado, puxe a pinça para cima e arrancar o globo ocular da órbita. O tecido do tipo fio branco é o nervo óptico.
- Colocar o olho em PBS. Utilizando uma agulha de calibre 30, fazer uma punção única ferida imediatamente posterior ao limbo, inserindo a agulha de 1-2 mm dentro do globo ocular. Isso permite que os fixadores, tais como glutaraldeído, que são de outro modo incapazes de penetrar no tecido do olho, para directamente enter o olho. Criação desse ferimento pode não ser necessário se um fixador, tal como paraformaldeído ou álcool, é capaz de difundir-se tecidos oculares de interesse.
- Coloque todo o olho imediatamente em fixador para fixação de imersão.
2. Dissecção aguda: Enucleação do mouse fixação perfusão olho seguinte
- Use uma curva colibri forcep para segurar a pálpebra para longe do globo.
- Tesoura Westcott Orient curvas dissecação paralelas ao mundo, com o objectivo para a parte traseira da órbita.
- Corte o tecido fixo conjuntivo que envolve o mundo dos inferiores, mediais, laterais superiores e lateral.
- Coloque a pinça curva atrás do globo, segure o tecido conjuntivo, sem pressionar no globo, e puxe para a frente a enuclear o olho. Uma vez que o tecido conjuntivo orbital é rígida de fixação da perfusão, o corte de tecidos orbitais adicional pode ser necessária para libertar completamente o globe.
3. Fixação e Embalagem
Envio de tecidos fixas devem seguir os seus requisitos de serviços institucionais e correios, incluindo etiquetas e embalagens apropriadas. O protocolo seguinte é um exemplo de envio de uma amostra biológica não infecciosa, à temperatura ambiente. Isto requer três camadas de embalagem, mas não de classe A substância / B biológica ou rótulos de azoto líquido.
- Colocar o olho para um frasco de cintilação de 5 ml de vidro com, pelo menos, fixador de 3 ml, ou pós-fixador tampão, se a fixação for curto. Escreva o número de rastreamento na tampa do frasco e feche-o com Parafilm.
- Frascos de cintilação lugar em uma amostra biológica aprovado contêiner de transporte. No nosso instituto, por exemplo, contentores aprovados requerem três camadas: um recipiente vedado no qual a amostra é colocada, uma camada intermédia absorvente, e uma camada protectora exterior.
- Colocar o recipiente num pacote de plástico-bolha e, em seguida, para uma aplicaçãocontêiner percorreram laboratório junto com a documentação adequada.
4. Resultados representativos
O exame histológico dos olhos pode ser efectuada por uma variedade de métodos incluindo hematoxilina-eosina, a detecção de expressão enzimática, a microscopia electrónica de transmissão, e imuno-histoquímica. Após fixação imersão em paraformaldeído a 4%, o tecido foi embebido em parafina e seccionados em micrótomo. No alto rendimento fenotipagem, analisamos seções aluno nervo óptico que todos os tipos de amostras de tecido do olho (Figura 1). Secções de tecido foram também examinados para expressão de lacZ (Figura 2), microscopia electrónica de transmissão de organelos celulares (Figura 3), e a expressão de moléculas específicas com anticorpos (Figura 4).
No nosso método de rastreio fenótipo, não foi importante para manter a orientação do olho em relação à nasal (canto medial) e temporal (Lateral) canto lados. Existem pelo menos duas opções, se a orientação do olho é necessário. Após enucleação, temos aplicado cautério luz na córnea temporais na posição das três horas com um cautério handheld. A lesão é óbvio na histologia e não ficar perdido durante o processamento, como tintas histológicas. A desvantagem é que os danos cautério a córnea, o que pode ser um tecido crucial para exame. A outra opção requer um anatomista qualificados que possam identificar as inserções dos músculos extraoculares. Sob um microscópio estereoscópico, a identificação da inserção do músculo oblíquo superior e inferior marca o aspecto inferior e superior e do mundo. 3 Com qualquer método de orientação, é importante acompanhar a amostra como um olho direito ou esquerdo. Juntos, isso vai permitir que a orientação exata mundo antes do corte.
Figura 1. Imagens do mouse olho histológicas afte r aquisição remota. olhos de camundongos foram enucleados por dissecção aguda após a fixação de perfusão com paraformaldeído 4%. A. Aluno-secção do nervo óptico corados com Hematoxilina e Eosina mostra preservação de todas as subestruturas de tecido. ON, nervo óptico. (Barra de escala verde = 500 microns) B. Uma visão maior ampliação da retina normal mostra sua estrutura laminar: RGC, as células ganglionares da retina; IPL, camada plexiforme interna; INL, camada interna nuclear; OPL, camada plexiforme externa; ONL, exterior camada nuclear (células fotorreceptoras) (seta); IS, segmentos fotorreceptoras internas (cabeça de seta); OS, fotorreceptoras segmentos exteriores; RPE, epitélio pigmentar da retina, c, coróide. (Verde barra de escala = 50 microns) C. Em comparação com a retina normal, este espécime é mais fina devido à degeneração dos fotorreceptores. O ONL, É e OS estão completamente ausentes (seta). (Verde barra de escala = 50 microns)
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Figura 2. Expressão de lacZ em murganhos transgénicos. Os olhos foram enucleados por dissecção romba e imersos em 1 mg / ml de solução de X-gal (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM de K4Fe (CN) 6, 2 mM de MgCl2, 0,02% de NP40 , e desoxicolato de sódio a 0,1%) durante a noite a 37 ° C. Os olhos foram fixados em glutaraldeído a 2% formaldehyde/0.2% durante 30 minutos e seccionados em micrótomo. X-gal do produto (azul) etiquetas: A. epitélio ciliar, B. epitélio da córnea, e C. a camada de células ganglionares da retina (RGC) na retina. INL, camada nuclear interna; ONL, camada nuclear externa.
Figura 3. Microscopia eletrônica de transmissão do epitélio pigmentar da retina (EPR). Após dissecção romba e criação de um ferimento, os olhos estavam fixos imersão em paraformaldeído 2,5% / 2,5% glutaraldeído em 0,1 M de tampão fosfato de sódio. Olhos eram secondarily fixado em textroxide de ósmio a 1%, gradualmente desidratados e embebidos em resina Spurr a. Tecido foi seccionado em 90 nm e colocados em grades de cobre cobertas de caça-níqueis e Formvar fotografada usando um microscópio eletrônico de transmissão. A micrografia mostra, os segmentos exteriores fotorreceptoras da retina neurosensorial, melanossomas (M) no interior do epitélio pigmentado da retina e membrana de Bruch.
Figura 4. Imunohistoquímica de superóxido dismutase-3 (verde) no vítreo do rato. Olhos foram enucleados por dissecção romba e foi submetido a fixação de imersão em paraformaldeído a 4%. Eles foram incluídos em parafina e seccionados usando um micrótomo. As secções de tecido foram incubadas com anti-soro policlonal de coelho diluído 1:50 SOD3. SOD3 expressão foi detectada utilizando um anticorpo de cabra anti-coelho IgG (H + L)-Alexa Fluor 488 anticorpo secundário conjugado. Rotulagem de SOD3 é mostrado na green.
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Discussion
Camundongos transgênicos mais existem em laboratórios que não examinam os olhos. Nossa técnica vídeo mostra um método simples e padronizada para a transferência remota de habilidade cirúrgica para otimizar a aquisição de tecidos a partir de laboratórios com pouca experiência com os olhos. Esta técnica de vídeo ajuda a superar um grande armadilha em alto rendimento fenotipagem, que é a utilização de um número limitado de locais especializados devido a métodos não normalizados de recolha de tecidos e que impedem a fixação significativas comparativas estudos fenotípicos e moleculares. Para estabelecer e manter o controlo de qualidade com qualquer novo laboratório remoto e técnico, é importante incluir os olhos de tipo selvagem, no início e periodicamente durante todo o estudo. Descobrimos também que um sistema de rastreamento é importante quando os olhos de vários múltiplos genótipos foram transferidos, como um sistema baseado na web para atribuir um número de identificação único para cada olho. Embora a fixação de maior qualidade e secções de tecidos posteriores são obtidos comperfusão fixos animais, descobrimos que espécimes enucleados de animais não corrigidos são suficientes para a maioria dos estudos morfológicos e moleculares. Além disso, a aquisição de olhos de animais não fixadas podem ser significativamente mais fácil de processar em alto rendimento estudos de diferentes fontes. Camundongos transgênicos são um importante instrumento para investigação da doença oftálmica humana, 10, 11 e aquisição de tecidos remoto para fenotipagem local faz ao máximo este recurso valioso. Aplicação de uma estratégia semelhante para dissecção dos tecidos e partilha pode ter um impacto importante no alto rendimento fenotipagem de não-tecidos oculares.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Pesquisa para prevenir a cegueira; Bartly J. Mondino MD, Diretor do Jules Stein Eye Institute, UCLA, e Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui Branco, e Jeanne Estabel no Instituto Sanger, Wellcome Trust Genome Campus. Esta pesquisa está em conformidade com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
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