Summary
Техника рассечения иллюстрирует энуклеации глаза мыши для фиксации тканей для выполнения фенотипирование в высокой пропускной способности экранов.
Abstract
Мышь глаз является важной генетической модели для поступательного изучения человеческих болезней глазной. Blinding заболеваний человека, таких как дегенерация желтого пятна, фоторецептор дегенерации, катаракты, глаукомы, ретинобластома, и диабетической ретинопатии были обобщены в трансгенных мышей. 1-5 большинства трансгенных и нокаутных мышей были получены в лабораториях для изучения без глазных заболеваний, но сохранения генетических ресурсов между системами органов предполагает, что многие из тех же генов также могут играть определенную роль в развитии глаз и болезни. Таким образом, эти мыши представляют собой важный ресурс для открытия новых генотип-фенотип корреляции в глаза. Потому что эти мыши разбросаны по всему миру, трудно приобретать, сохранять, и фенотип их в эффективные, экономически эффективным образом. Таким образом, наиболее высокую пропускную способность экранов офтальмологической фенотипирование ограничены несколько мест, которые требуют на месте, глазные экспертизы для изучения глаза в живых мышей. 6-9 альтернативный подход, разработанный нашей лаборатории является методом для удаленного ткани приобретения, которые могут использоваться в больших или малых масштабах исследования трансгенных мышей глаза. Стандартизированных процедур для видео-хирургической передаче навыков, ткани фиксации и доставки позволяют любой лаборатории, чтобы собрать весь глаз от мутантных животных и отправить их на молекулярном и морфологическом фенотипирования. В этом видео статье мы представляем методы выяснять и передавать как нефиксированные и перфузии фиксированной глазах мышь для удаленного анализа фенотипа.
Protocol
1. Тупой диссекции: энуклеации глаза мышей в образцах незаписанных
- Растащить веки, чтобы улучшить экспозицию и доступ к заднему мира (глазного яблока) поверхности.
- Разместите изогнутый forcep повязки за (под) мира в орбиту (глазницы). Mahajan Sharptip соусом forcep является пользовательский инструмент с острыми концами, чтобы сделать этот шаг легче (см. материалы и реагенты таблицу).
- Закройте forcep и понять орбитальной соединительной ткани и зрительного нерва позади миру, стараясь при этом, чтобы избежать сжатия земного шара.
- Осторожно потяните вверх forcep и срывать глазного яблока с орбиты. Белые нитевидные ткани зрительного нерва.
- Поместите глаз в PBS. Использование 30-иглу, сделать один прокол рану сразу же позади лимба, вставив иглу 1-2 мм в глазное яблоко. Это позволяет фиксаторов, таких как глутаральдегида, которые в противном случае не может проникнуть в ткани глаза, непосредственно антер глаза. Создание этого прокола рана не может быть необходимым, если фиксаторы, такие как параформальдегид или спирт, способны диффундировать в глазных тканях интерес.
- Поместите весь глаз сразу в фиксатор для погружения фиксации.
2. Sharp Dissection: Энуклеация из следующих мыши фиксацией перфузии глаза
- Использование изогнутых Colibri forcep провести веко от мира.
- Orient изогнутые Уэсткотт рассечение ножницами параллельном мире, стремясь к задней части орбиты.
- Вырезать фиксированной соединительной ткани, которая окружает земной шар из нижнего, медиальная, начальника, и боковые стороны.
- Поместите изогнутые forcep позади мира, возьмитесь за соединительную ткань, не нажимая на земном шаре, и потяните вперед, чтобы выяснять глаз. С орбитальной соединительной ткани жесткая фиксация от перфузии, дополнительные резки тканей орбиты могут быть необходимы, чтобы полностью освободить шаре.
3. Фиксация и упаковка
Доставка основной ткани должны следовать вашей организации и почтовые службы, включая требования соответствующие этикетки и упаковки. Следующий протокол является примером грузить неинфекционной биологических образцов при комнатной температуре. Для этого требуется 3 слоя упаковки, но не класса A / B биологическим веществом или жидкостью этикетки азота.
- Поместите глаз в 5-мл флаконе сцинтилляционного стекла, по крайней мере 3-мл фиксатора, или пост-фиксатор буфера, если фиксация коротких. Написать идентификационный номер на крышке флакона и запечатать его с Parafilm.
- Место сцинтилляционные флаконы в биологическом образце транспортную тару. В нашем институте, например, в специальных контейнерах требует трех слоев: герметичный контейнер, в котором образец помещается, абсорбирующий слой среднего и защитным внешним слоем.
- Поставьте контейнер в пузырь-обертывание пакет, а затем в приложениеблуждал контейнерных перевозок лаборатории вместе с соответствующей документацией.
4. Представитель Результаты
Гистологическое исследование глаз может быть выполнено различными способами, включая гематоксилином и эозином, ферментативные обнаружения выражения, просвечивающей электронной микроскопии и иммуногистохимии. После погружения фиксации в 4% параформальдегид, ткани в парафин и подразделяются на микротоме. В высокой пропускной фенотипирование, мы анализируем ученик-оптический нерв, который разделов образцов всех типов тканей в глаза (рис. 1). Разделы ткани были также исследованы на LacZ выражении (рис. 2), просвечивающей электронной микроскопии клеточных органелл (рис. 3), и экспрессии специфических молекул антител (рис. 4).
В нашем методе отбора фенотип, это не было важно для поддержания ориентации глаз по отношению к носовой (медиальной угла глазной щели) и временные (Lateraл угла глазной щели) сторон. Есть как минимум два варианта, если глаза ориентация является необходимой. После энуклеации, мы применили свет прижигания к временному роговицы в 3:00 позицию с портативных устройств прижигания. Поражение очевидно, по гистологии и не теряются в процессе обработки, как гистологическое красками. Недостатком является то, что прижигание повреждения роговицы, которое может быть критическим ткани для исследования. Второй вариант требует квалифицированного анатом, которые могут идентифицировать глазных мышц вставками. В стереомикроскопа, определение нижней и верхней косой мышцы вставки отмечает низшие и высшие, и аспект земного шара. 3 с любой ориентации метод, важно отслеживать образца в правом или левом глазу. Вместе, это позволит точной ориентации миру до секционирования.
Рисунок 1. Мышь глаза гистологических изображений Afte Г удаленного сбора. Мыши глаза энуклеировали резкой расчлененности после перфузии фиксации с 4% параформальдегида. А. Ученик-оптический нерв разделе окрашивали гематоксилином и эозином показывает сохранение всех тканей подструктур. ON, зрительного нерва. (Зеленая шкалы = 500 мкм) B. большим увеличением зрения нормальной сетчатки показывает его слоистой структуры: РСК, ганглиозных клеток сетчатки; IPL, внутренний слой плексиформные; INL, внутренний ядерный слой; OPL, внешний слой плексиформные; ONL, внешний ядерного слоя (клетки фоторецептора) (стрелка); И.С., фоторецептор внутренний сегменты (стрелки); OS, наружных сегментов фоторецепторов, НПП, пигментный эпителий сетчатки, C, сосудистой оболочки. (Зеленая шкала бар = 50 мкм) C. По сравнению с нормальным сетчатки, этот образец тоньше из-за дегенерации фоторецепторов. ONL, IS, и ОС полностью отсутствуют (стрелка). (Зеленая шкала бар = 50 мкм)
"ALT =" Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. LacZ экспрессии в трансгенных мышах. Глаза были энуклеировали тупым рассечением и погружают в 1 мг / мл X-гал решения (5 мМ K3Fe (CN) 6, 5 мМ K4Fe (CN) 6, 2 мМ MgCl2, 0,02% NP40 и 0,1% дезоксихолат натрия) в течение ночи при 37 ° C. Глаза были зафиксированы в 2% formaldehyde/0.2% глутарового альдегида в течение 30 минут и подразделяются на микротоме. X-гал продукта (синий) этикетки: А. мерцательного эпителия, Б. эпителия роговицы и С. ганглиозных клеток сетчатки (РГК) слой сетчатки. INL, внутренний ядерный слой; ONL, наружный ядерный слой.
Рисунок 3. Просвечивающей электронной микроскопии пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). После тупой диссекции и создание прокола раны, глаза были зафиксированы погружением в 2,5% параформальдегид / 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М натрий-фосфатного буфера. Глаза были вторичdarily фиксировали в 1% осмия textroxide, постепенно обезвожен, и встроенный в смоле Spurr автора. Ткань была разрезе на 90 нм и помещают на медь слот сетей рассматривается в формвар и отображаемого помощью просвечивающего электронного микроскопа. Микрофотография показывает, наружных сегментов фоторецепторов нейросенсорной сетчатки, меланосом (M) в течение пигментного эпителия сетчатки, а также мембраны Бруха.
Рисунок 4. Иммуногистохимическое маркировки супероксиддисмутаза-3 (зеленый) у мышей стекловидного тела. Глаза были энуклеировали тупым рассечением и прошли погружения фиксации в 4% параформальдегид. Они заливали в парафин и секционного использованием микротоме. Срезы тканей инкубировали с кроличьими поликлональными SOD3 антисыворотки разводят 1:50. SOD3 выражение было обнаружить с помощью козьего анти-кроличий IgG (H + L)-Alexa Fluor 488 сопряженных вторичными антителами. Маркировка SOD3 показано в GREеп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство трансгенных мышей существуют в лабораториях, которые не рассматривают глаза. Наше видео техника иллюстрирует простой, стандартизированный метод для удаленной передачи хирургических навыков для оптимизации ткани приобретение из лабораторий с небольшим опытом работы с глазами. Это видео техника помогает преодолеть основные ловушки, в высокой пропускной способности фенотипирование, что использование ограниченного числа экспертов сайтов за счет нестандартных коллекции тканей и фиксацией методы, которые препятствуют значимые сравнительный фенотипических и молекулярных исследований. Чтобы установить и поддерживать контроль качества и с любой новой удаленной лаборатории и техник, важно, чтобы включить дикого типа глаз в начале и периодически на протяжении всего исследования. Мы также обнаружили, что система отслеживания важно, когда несколько глаз от нескольких генотипов были переданы, таких как веб-системы присвоить уникальный идентификационный номер для каждого глаза. Хотя повышение качества фиксации и последующих разделах ткани, полученные сперфузии фиксированной животных, мы обнаружили, что образцы энуклеировали с нефиксированной животных достаточно для большинства морфологических и молекулярных исследований. Кроме того, приобретение глаза от незаписанных животных может быть значительно легче обрабатывать в высокой пропускной исследований из различных источников. Трансгенные мыши, являются важным инструментом для изучения человеческих болезней офтальмологических, 10, 11 и удаленного сбора тканей для местных фенотипирование делает большую часть этого ценного ресурса. Применение подобной стратегии для рассечения тканей и обмен может иметь важное влияние на высокую пропускную способность фенотипирование без офтальмологической тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Исследования по профилактике слепоты; Бартли J. Mondino MD, директор Jules Stein Eye Institute, Лос-Анджелесе, и Рамиро Рамиреса-Солис, Джеки белый, и Жанна Estabel в Sanger института Wellcome Trust генома Campus. Это исследование соответствует ARVO Заявление для использования животных в офтальмологический и визуальных исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
