Summary
La técnica de disección ilustra la enucleación del ojo del ratón para la fijación del tejido para realizar el fenotipado de alto rendimiento pantallas.
Abstract
El ojo del ratón es un modelo genético importante para el estudio de traslación de la enfermedad oftálmica humano. Enfermedades que causan ceguera en los seres humanos, como la degeneración macular, degeneración de los fotorreceptores, las cataratas, el glaucoma, el retinoblastoma y la retinopatía diabética se han recapitulado en ratones transgénicos. 1-5 mayoría de los ratones transgénicos y knock-out han sido generados por los laboratorios para estudiar las enfermedades no oftalmológicas, pero conservación genética entre los sistemas de órganos sugiere que muchos de los mismos genes también puede desempeñar un papel en el desarrollo y la enfermedad ocular. Por lo tanto, estos ratones representan un recurso importante para el descubrimiento de nuevas correlaciones genotipo-fenotipo en el ojo. Debido a que estos ratones se encuentran dispersos en todo el mundo, es difícil de adquirir, mantener y fenotipo ellos de una manera eficiente y rentable manera. Así, la mayoría de alto rendimiento pantallas fenotipificación oftálmicas se limita a unos pocos lugares que requieren en el lugar, la experiencia oftálmica para examinar los ojos en ratones vivos. 6-9 Un enfoque alternativo desarrollado por nuestro laboratorio es un método para la adquisición remota de tejido que se puede utilizar en grandes encuestas o en pequeña escala de los ojos de ratones transgénicos. Los procedimientos estandarizados de vídeo basado en la transferencia de habilidades quirúrgicas, la fijación del tejido, y el envío permitir que cualquier laboratorio para recolectar los ojos enteros de animales mutantes y enviarlos por fenotipificación molecular y morfológica. En este artículo, video, presentamos las técnicas de la enucleación y transferir los ojos fijos tanto no fijadas y la perfusión de ratón para el análisis fenotípicos remotos.
Protocol
1. Disección Blunt: Enucleación del ojo del ratón en las muestras no fijadas
- Separar los párpados para mejorar la exposición y el acceso al mundo posterior (globo ocular) superficie.
- Coloque un vendaje fórceps curvo detrás (en) el mundo en la órbita (cuenca del ojo). El Mahajan Sharptip aderezo fórceps es un instrumento de medida con puntas de hacer este paso más fácil (ver materiales y reactivos de mesa).
- Cierre la pinza y agarrar el tejido conectivo orbital y el nervio óptico detrás del globo mientras que teniendo cuidado de evitar apretar el globo.
- Retire con cuidado la pinza hacia arriba y coger el globo ocular de la órbita. El blanco de hilo tejido es el nervio óptico.
- Coloque el ojo en PBS. Usando una aguja de calibre 30-, hacer una punción única herida inmediatamente posterior al limbo mediante la inserción de la aguja 1-2 mm en el globo ocular. Esto permite fijadores, tales como glutaraldehído, que de otro modo son incapaces de penetrar en el tejido del ojo, a directamente enter el ojo. La creación de esta herida de punción puede no ser necesario si un fijador, tal como paraformaldehído o alcohol, es capaz de difundirse en los tejidos oculares de interés.
- Coloque todo el ojo inmediatamente en fijador para la fijación de inmersión.
2. Disección de Sharp: Enucleación de la fijación del ojo del ratón perfusión siguiente
- Utilice un fórceps curvo colibri y mantiene los párpados lejos del mundo.
- Orient curvas tijeras de Westcott disección paralelas al mundo, mientras apuntando hacia la parte posterior de la órbita.
- Cortar el tejido conectivo que rodea fijo el mundo, desde las inferiores, a los lados medial, superior y lateral.
- Coloque la pinza curvada detrás del globo, sujete el tejido conectivo sin presionar en el mundo, y tire hacia adelante la enucleación del ojo. Dado que el tejido conjuntivo orbital es rígido en fijación por perfusión, de corte adicional de los tejidos orbitales puede ser necesaria para liberar completamente la globe.
3. La fijación y embalaje
Envío de los tejidos fijos deben seguir sus requerimientos de servicios institucionales y los servicios postales, incluyendo las etiquetas y envases apropiados. El protocolo siguiente es un ejemplo de envío de una muestra biológica no infecciosa a temperatura ambiente. Esto requiere 3 capas de embalaje, pero no de clase Sustancia / B biológico o etiquetas de nitrógeno líquido.
- Coloque el ojo en un vial de vidrio de 5-mL de centelleo con al menos 3-ml fijador, o tampón de post-fijador si la fijación es corto. Escribir el número de seguimiento en la tapa del vial y sellarlo con Parafilm.
- Colocar los viales de centelleo en una muestra biológica aprobada contenedor de envío. En nuestro instituto, por ejemplo, contenedores aprobados requieren tres capas: un recipiente sellado en el que se coloca la muestra, una capa intermedia absorbente, y una capa protectora externa.
- Colocar el recipiente en un paquete de burbuja y luego en una aplicaciónlaboratorio Roved contenedor de transporte junto con la documentación apropiada.
4. Los resultados representativos
El examen histológico de los ojos puede ser realizada por una variedad de métodos que incluyen hematoxilina y eosina tinción, la detección de la expresión enzimática, microscopía electrónica de transmisión, y la inmunohistoquímica. Después de la fijación de inmersión en paraformaldehído al 4%, el tejido se embebió en parafina y se seccionaron con un microtomo. En alto rendimiento fenotipificación, se analiza óptica de alumnos por secciones nerviosas que muestra todos los tipos de tejidos en el ojo (Figura 1). Las secciones de tejido también se examinaron para la expresión de lacZ (Figura 2), microscopía electrónica de transmisión de los orgánulos celulares (Figura 3), y la expresión de moléculas específicas con anticuerpos (Figura 4).
En nuestro método de cribaje fenotipo, que no era importante para mantener la orientación del ojo con respecto a la nasal (canto medial) y temporal (Lateral) canto lados. Hay por lo menos dos opciones si la orientación del ojo es necesario. Después de la enucleación, hemos aplicado cauterización luz en la córnea temporal en la posición de las tres con un dispositivo de cauterio de mano. La lesión es evidente en la histología y no se pierde durante el procesamiento como tintas histológicos. La desventaja es que los daños de cauterización de la córnea, que puede ser un tejido crítico para su examen. La otra opción requiere un anatomista experto que pueda identificar a las inserciones de los músculos extraoculares. Bajo un microscopio estereoscópico, la identificación de la inserción del músculo oblicuo inferior y superior marca el aspecto inferior y superior y del globo. 3 Con cualquier método de orientación, es importante realizar el seguimiento del espécimen, tal como un ojo derecho o izquierdo. En conjunto, esto permitirá orientación globo exacto antes de cortar.
Figura 1. Imágenes histológicas ratón ojo afte r adquisición remota. ojos fueron enucleados ratón por disección aguda posterior a la fijación de perfusión con paraformaldehído al 4%. A. alumnos por sección del nervio óptico se tiñeron con hematoxilina y eosina demuestra la preservación de todas las subestructuras de tejidos. ON, nervio óptico. (Barra de escala = 500 micras verde) B. Una visión un aumento mayor de la retina normal muestra su estructura laminar: las células ganglionares de la retina, RGC; capa IPL, plexiforme interna, capa INL, nuclear interna, capa OPL, plexiforme externa; ONL, exterior capa nuclear (células fotorreceptoras) (flecha); IS, segmentos fotorreceptores interiores (cabeza de flecha); OS, fotorreceptoras segmentos externos; RPE, epitelio pigmentario de la retina, coroides, c. (Barra de escala = verde 50 micras) C. En comparación con la retina normal, esta muestra es más delgada debido a la degeneración de los fotorreceptores. La ONL, IS y OS están completamente ausentes (flecha). (Barra verde escala = 50 micras)
"Alt =" Figura 2 "/>
Figura 2. Expresión de lacZ en ratones transgénicos. Los ojos fueron enucleados mediante disección roma y se sumergieron en 1 mg / ml de X-gal solución (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM K4Fe (CN) 6, 2 mM MgCl2, 0,02% de NP40 , y 0,1% de desoxicolato de sodio) durante la noche a 37 ° C. Ojos se fijaron en glutaraldehído al 2% formaldehyde/0.2% durante 30 minutos y se seccionaron con un microtomo. X-gal de productos (azul) etiquetas: el epitelio ciliar A., B. epitelio corneal, y la célula C. ganglionares de la retina (RGC) de capa en la retina. INL, la capa nuclear interna, capa ONL, nuclear externa.
Figura 3. Microscopía electrónica de transmisión de epitelio pigmentario de la retina (RPE). Después de la disección roma y la creación de una herida por punción, ojos eran de inmersión fijos en 2,5% de paraformaldehído / 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M de tampón fosfato de sodio. Los ojos eran de segundadarily fijado en textroxide de osmio al 1%, se deshidrataron gradualmente, y se incluyeron en resina de Spurr. El tejido se seccionó a 90 nm y se colocaron en rejillas de ranura de cobre Formvar y cubiertos en imágenes utilizando un microscopio electrónico de transmisión. La micrografía muestra, los segmentos externos de los fotorreceptores de la retina neurosensorial, melanosomas (M) en el epitelio pigmentario de la retina, y la membrana de Bruch.
Figura 4. Marcaje inmunohistoquímico de superóxido dismutasa-3 (verde) en el vítreo del ratón. Los ojos fueron enucleados mediante disección roma y se sometieron a fijación inmersión en paraformaldehído al 4%. Ellos fueron incluidos en parafina y se seccionaron utilizando un micrótomo. Las secciones de tejido se incubaron con antisuero policlonal de conejo diluido 1:50 SOD3. SOD3 expresión se detectó usando un anticuerpo de cabra anti-conejo IgG (H + L)-Alexa Fluor 488 de anticuerpo secundario conjugado. Etiquetado de SOD3 se muestra en green.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mayoría de los ratones transgénicos que existen en laboratorios que no examinan los ojos. Nuestra técnica de vídeo ilustra un método simple estandarizado para la transferencia remota habilidad quirúrgica para optimizar la adquisición de tejido de laboratorios con poca experiencia con los ojos. Esta técnica ayuda a vídeo superar un escollo importante en alto rendimiento fenotipificación, que es el uso de un número limitado de sitios de expertos por razones de métodos no normalizados de recogida de tejido y la fijación que impiden significativas estudios comparativos fenotípicas y moleculares. Para establecer y mantener el control de calidad con cualquier nuevo laboratorio remoto y técnico, es importante incluir de tipo salvaje ojos en el inicio y periódicamente durante todo el estudio. También se encontró que un sistema de seguimiento es importante cuando los ojos múltiples de múltiples genotipos fueron transferidos, tal como un sistema basado en Internet para asignar un número de identificación único para cada ojo. Aunque la mayor calidad y la fijación de las siguientes secciones de tejido se obtuvieron conperfusión fijos animales, encontramos que los especímenes enucleado de animales no fijadas son suficientes para la mayoría de los estudios morfológicos y moleculares. Además, la adquisición de los ojos de los animales no fijadas pueden ser significativamente más fáciles de procesar en estudios de alto rendimiento de diferentes fuentes. Los ratones transgénicos son un instrumento importante para la investigación de la enfermedad oftálmica humano, 10, 11 y la adquisición de tejido remoto para fenotipificación local hace que la mayor parte de este valioso recurso. La aplicación de una estrategia similar para la disección del tejido y el intercambio puede tener un impacto importante en alto rendimiento fenotipificación de los tejidos oftálmicos no.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Investigación para Prevención de la Ceguera; Bartly J. Mondino MD, Director del Jules Stein Eye Institute de UCLA, y Ramiro Ramírez-Solís, Jacqui Blanca, y Jeanne Estabel en el Instituto Sanger, Wellcome Trust Genoma Campus. Esta investigación cumple con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftalmológica y Visual.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
