Summary
Dissektion Tekniken visar enucleation av musen öga för vävnadsfixering att utföra fenotypning i hög genomströmning skärmar.
Abstract
Musen ögat är en viktig genetisk modell för translationella studier av mänsklig oftalmisk sjukdom. Bländande sjukdomar hos människor, såsom makuladegeneration, ljusmätare degeneration, katarakt, glaukom, retinoblastom, och diabetesretinopati har rekapituleras i transgena möss. 1-5 flesta transgena och knockout möss har genererats av laboratorier för att studera icke-ögonsjukdomar, men genetisk bevarande mellan organsystem tyder på att många av de samma gener också kan spela en roll i okulär utveckling och sjukdom. Därför är dessa möss utgör en viktig resurs för att upptäcka nya genotyp-fenotyp korrelationer i ögat. Eftersom dessa möss är utspridda över hela världen, är det svårt att få, underhålla och fenotyp dem på ett effektivt och kostnadseffektivt sätt. Således är de flesta hög kapacitet oftalmiska fenotypning skärmar begränsad till ett fåtal platser som kräver på plats, oftalmisk expertis för att undersöka ögonen på levande möss. 6-9 Ett alternativt tillvägagångssätt som utvecklats av vårt laboratorium är en metod för avlägsen vävnads-förvärv som kan användas i stora eller små skala undersökningar av transgen mus ögon. Standardiserade förfaranden för video-baserade kirurgiska kunskapsöverföring, vävnad fixering och sjöfart tillåta labb för att samla hela ögon muterade djur och skicka dem för Molekylär och morfologisk fenotypning. I den här videon artikeln presenterar vi tekniker för att enucleate och överföra både ofixerade och perfusion fasta mus ögon för avlägsna fenotypning analyser.
Protocol
1. Dissektion: enucleation av musen ögat ofixerade prover
- Dra isär ögonlocken för att förbättra exponeringen och tillgång till den bakre världen (ögongloben) yta.
- Placera en böjd förband tång bakom (under) jorden i omloppsbana (ögonhålan). Den Mahajan Sharptip förband tång är en anpassad instrument med spetsiga tips för att göra detta steg enklare (se material och reagenser tabell).
- Stäng tång och ta tag i omloppsbanor bindväv och synnerven bakom världen samtidigt som noga med att undvika att klämma världen.
- Dra försiktigt tång uppåt och plocka ögongloben från omloppsbana. Den vita trådliknande vävnad är synnerven.
- Placera ögat i PBS. Med hjälp av en 30-gauge nål, göra en enda punktering sår omedelbart posteriort om limbus genom att sätta nålen 1-2 mm i ögongloben. Detta tillåter fixativ, såsom glutaraldehyd, som annars inte kan penetrera ögonvävnad, att direkt svTER ögat. Skapande av denna sår behöver inte vara nödvändigt om en fixativ, såsom paraformaldehyd eller alkohol, är i stånd att diffundera in i okulära vävnader av intresse.
- Placera hela ögat omedelbart i fixativ för nedsänkning fixering.
2. Sharp Dissection: enucleation av musen ögat efter perfusion fixering
- Använd en böjd colibri tång för att hålla ögonlocket bort från världen.
- Orient böjda Westcott dissekering sax parallellt med världen, samtidigt som syftar mot baksidan av banan.
- Skär den fasta bindväv som omger jorden från sämre, mediala, överlägsen, och laterala sidor.
- Placera den böjda tång bakom världen, ta tag i bindväven utan att trycka på jorden, och dra fram enucleate ögat. Eftersom den kretsande bindväv är hård från perfusion fixering kan ytterligare skärning i omloppsbanor vävnader vara nödvändiga för att helt släppa globe.
3. Fixering och förpackning
Frakt av fasta vävnader måste följa dina institutionella och postservice krav, inklusive lämpliga etiketter och förpackningar. Följande protokoll är ett exempel för transport av en icke-infektiös biologiskt prov vid rumstemperatur. Detta kräver 3 lager av förpackningar men ingen klass A / B biologisk substans eller flytande etiketter kväve.
- Placera ögat i en 5-ml glasscintillationsflaska med minst 3-ml fixativ, eller post-fixativ buffert om fixering är kort. Skriv RMA-numret på locket på flaskan och försegla den med Parafilm.
- Placera scintillationsfläskor i ett biologiskt prov godkänd transportbehållare. I vårt institut, exempelvis godkända förpackningar kräver tre skikt: en förseglad behållare, i vilken provet är placerat, ett absorberande mittskikt, och ett skyddande yttre skikt.
- Placera behållaren i en bubbla-wrap paketet och sedan i en appirrade laboratorium container tillsammans med lämplig dokumentation.
4. Representativa resultat
Histologisk undersökning av ögonen kan utföras genom en mängd olika metoder, inklusive hematoxylin och eosin-färgning, enzymatisk uttryck upptäckt, transmissionselektronmikroskopi, och immunohistokemi. Efter nedsänkning fixering i 4% paraformaldehyd, var vävnaden inbäddades i paraffin och sektionerades på en mikrotom. I hög kapacitet fenotypning analyserar vi elev-optiska nerv sektioner som prov alla vävnadstyper i ögat (Figur 1). Sektioner av vävnad undersöktes också för lacZ-uttryck (figur 2), transmissionselektronmikroskopi av cellulära organeller (figur 3), och uttryck av specifika molekyler med antikroppar (Figur 4).
I vår fenotyp screeningmetod, var det inte viktigt att bibehålla orienteringen av ögat i förhållande till nasala (mediala canthus) och timliga (Lateral canthus) sidor. Det finns åtminstone två alternativ om ögat orientering är nödvändig. Efter enukleation har vi tillämpat ljus diatermi på den temporala hornhinnan vid 03:00 position med en handhållen diatermi enhet. Lesionen är uppenbart på histologi och inte gå vilse under bearbetning som histologiska bläck. Nackdelen är att kauterisation skadar hornhinnan, vilket kan vara en kritisk vävnad för undersökning. Det andra alternativet kräver en skicklig anatom som kan identifiera de extraokulära muskel infogningar. Under ett stereomikroskop, markerar identifiering av lägre och högre sneda muskel insättning den lägre och högre och del av världen. 3 Med båda orientering metod är det viktigt att följa provet som höger eller vänster öga. Tillsammans kommer detta att exakt glob orientering före snittning.
Figur 1. Mus ögat histologiska bilder efter genomförd R Remote förvärvet. Mus ögon enukleation av kraftiga dissektion efter perfusion fixering med 4% paraformaldehyd. A. Elev-synnerven sektionen färgas med hematoxylin och eosin visar bevarandet av alla vävnad understrukturer. ON, synnerven. (Grön skala bar = 500 mikron) B. En högre förstoring bild av den normala näthinnan visar sin laminär struktur: RGC, näthinneganglieceller, IPL, inre plexiform lager, INL, inre nukleära lagret, OPL, yttre plexiform lager, ENDA, yttre kärnlagret (fotoreceptorcell) (pil), IS, fotoreceptor inre segment (pilspets), OS, fotoreceptor yttre segment, RPE, pigmentepitelet, C, åderhinnan. (Grön skala bar = 50 mikron) C. Jämfört med normala näthinnan är denna prov tunnare på grund av ljusmätare degeneration. Den ENDA, är och OS är helt frånvarande (pil). (Grön skala bar = 50 mikrometer)
"Alt =" Bild 2 "/>
Figur 2. LacZ-uttryck i transgena möss. Ögonen enukleation genom trubbig dissektion och nedsänktes i 1 mg / ml X-gal-lösning (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM K4Fe (CN) 6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP40 , och 0,1% natriumdeoxikolat) över natten vid 37 ° C. Ögonen fixerades i 2% formaldehyde/0.2% glutaraldehyd under 30 minuter och sektionerade på en mikrotom. X-gal produkten (blå) etiketter: A. ciliär epitel, B. hornhinneepitelet, och C. näthinnans gangliecell (RGC) skikt i näthinnan. INL, inre nukleära lagret, ENDA, yttre nukleära lagret.
Figur 3. Transmissionselektronmikroskopi av retinal pigment (RPE). Efter dissektion och skapandet av en sår var ögon nedsänkning fixerades i 2,5% paraformaldehyd / 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumfosfatbuffert. Ögon var secondarily fast i 1% osmium textroxide gradvis uttorkad och inbäddade i Spurr s harts. Vävnad sektionerades vid 90 nm och placeras på galler koppar slot täckta i Formvar och avbildades med användning av ett transmissionselektronmikroskop. Mikrofotografiet visar, fotoreceptor yttre delar av neurosensoriska näthinnan, melanosomer (M) inom pigmentepitelet och Bruchs membran.
Figur 4. Immunohistokemisk märkning av superoxiddismutas-3 (grön) i musens glaskroppen. Ögonen enukleation genom trubbig dissektion och genomgick nedsänkning fixering i 4% paraformaldehyd. De inbäddades i paraffin och sektionerades med en mikrotom. Vävnadssektioner inkuberades med kanin polyklonalt antiserum SOD3 utspädd 1:50. SOD3 uttryck detekterades med användning av en get-anti-kanin-IgG (H + L)-Alexa Fluor 488-konjugerad sekundär antikropp. Märkning av SOD3 visas i GREsv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De flesta transgena möss finns i laboratorier som inte undersöka ögonen. Vår videoteknik illustrerar en enkel, standardiserad metod för fjärrstyrning kirurgisk kunskapsöverföring för att optimera mjukpappersförvärvet från laboratorier med liten erfarenhet med ögonen. Denna video teknik hjälper övervinna en stor fallgrop i hög genomströmning fenotypning, vilket är användningen av ett begränsat antal experter platser på grund av icke-standardiserade vävnad insamling och fixering metoder som hindrar meningsfulla jämförande fenotypiska och molekylära studier. Att skapa och upprätthålla kvalitetskontrollen med alla nya fjärrkontroll labb och tekniker, är det viktigt att inkludera vildtyp ögon i början och med jämna mellanrum under studien. Vi fann också att ett system för spårning är viktig när flera ögon från flera genotyper överfördes såsom ett webbaserat system för att tilldela ett unikt identifikationsnummer för varje öga. Fastän högre kvalitet fixering och efterföljande sektioner vävnad erhålls medperfusion-fixerade djur finner vi att prover enukleation från ofixerade djur är tillräckliga för de flesta morfologiska och molekylära studier. Dessutom kan förvärv av ögonen från ofixerade djur vara betydligt lättare att bearbeta i hög genomströmning studier från olika källor. Transgena möss är ett viktigt instrument för att undersöka ögat till människa sjukdomar, 10, 11 och avlägsna vävnad förvärv för lokal fenotypning gör det mesta av denna värdefulla resurs. Tillämpning av en liknande strategi för vävnad dissektion och delning kan ha en stor inverkan på hög genomströmning fenotypning av icke-oftalmiska vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Forskning för att förhindra blindhet, Bartly J. Mondino MD, chef för Jules Stein Eye Institute, UCLA och Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui White och Jeanne Estabel på Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus. Denna forskning uppfyller ARVO uttalande för användning av djur i Ophthalmic och Visual Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
