Summary
Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.
Abstract
Het microvasculaire endotheel speelt een belangrijke rol als een selectief doorlaatbaar barrière voor vloeistoffen en opgeloste stoffen. De lijm verbindingen tussen endotheelcellen regelen doorlaatbaarheid van het endotheel, en vele studies hebben gewezen op de belangrijke bijdrage van het actine cytoskelet om te bepalen junctionele integriteit 1-5. Een corticale actine riem wordt gedacht dat belangrijk voor het behoud van stabiele knooppunten 1, 2, 4, 5. In tegenstelling, zijn actine stress-vezels dacht centripetale spanning binnen endotheelcellen die knooppunten 2-5 verzwakt genereren. Veel van deze theorie is gebaseerd op studies waarin endotheelcellen worden behandeld met inflammatoire mediatoren waarvan bekend is dat endotheliale permeabiliteit te verhogen, en vervolgens tot vaststelling van de cellen en de etikettering F-actine voor microscopisch observatie. Echter, deze studies een zeer beperkt begrip van de rol van het actine cytoskelet omdat beelden van de vaste cellen voorzien alleen snapshots intijd zonder informatie over de dynamiek van actine structuren 5.
Live-cell imaging maakt integratie van de dynamische aard van het actine cytoskelet in de studies van de mechanismen die bepalen endotheliale barrière integriteit. Een groot voordeel van deze methode is dat de impact van verschillende inflammatoire stimuli op actine structuren in endotheelcellen kan worden beoordeeld in dezelfde set van levende cellen voor en na behandeling, het verwijderen van mogelijke vertekening die zich kunnen voordoen bij het observeren van vaste exemplaren. Humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) zijn getransfecteerd met een GFP-β-actine plasmide en uitgegroeid tot confluentie op glazen dekglaasjes. Time-lapse beelden van de GFP-actine in confluerende HUVEC worden opgevangen voor en na de toevoeging van ontstekingsmediatoren die tijd-afhankelijke veranderingen in de endotheliale barrière integriteit te lokken. Deze studies kunnen visuele waarneming van de vloeistof opeenvolging van veranderingen in het actine cytoskelet die bijdragen aan endotheell barrière verstoring en restauratie.
Onze resultaten blijkt nog steeds lokaal, actine-rijke lamellipodia vorming en de omzet in endotheelcellen. De vorming en beweging van actine stress-vezels kunnen ook worden waargenomen. Een analyse van de frequentie van de vorming en de omzet van de plaatselijke lamellipodia, voor en na behandeling met inflammatoire stimuli kunnen worden gedocumenteerd door kymograaf analyses. Deze studies geven belangrijke informatie over het dynamische karakter van het actine cytoskelet in endotheelcellen die gebruikt kunnen worden om eerder geïdentificeerde moleculaire mechanismen van belang voor het behoud van de endotheliale barrière integriteit te ontdekken.
Protocol
1. Transfectie van HUVEC met GFP-actine
- Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om HUVEC transfecteren. Ons laboratorium maakt gebruik van het Nucleofector systeem (Lonza, Basel Zwitserland) hieronder uiteengezet. In het algemeen snel te werk gaan om levensvatbaarheid van de cellen en de transfectie-efficiëntie te verbeteren. Elke transfectie vereist 5 x 10 5 HUVEC die zullen worden gezaaid op twee glazen dekglaasjes (Corning nr. 1, 22 x 50 mm). De Nucleofector combineert elektroporatie en chemische reagentia aan transfecteren plasmide DNA, en meestal bereikt een> 50% uitdrukking efficiency. Chemische transfectie reagentia zijn een alternatieve methode. De ene groep heeft met succes getransfecteerde runderen endotheliale cellen met GFP-actine met behulp van de GenePORTER reagens 6. De Nucleofector protocol die we gebruiken wordt hieronder beschreven.
- Presterilized cultureware of gewone dekglaasjes kan worden gebruikt, afhankelijk van de kamer type. Voor glas dekglaasjes, steriliseren in een biologisch veilig kap door het plaatsen van de ze in een 10 cm cultuur plaatmet ongeveer 5 ml 70% ethanol gedurende 2 minuten. Pak ze op met een steriele pincet en drogen aan de lucht door te leunen ze tegen de zijkant van een aparte cultuur plaat.
- Eenmaal droog, plaats elke dekglaasje in zijn eigen 10 cm cultuur plaat. Pipetteer een 300 pi kraal van de warme gelatine-oplossing (1,5% in 0,9% NaCl) op het midden van het dekglaasje en laat het staan voor 5 minuten., En dan zuigen. Het houden van deze matrix coating in het centrum, zonder het aanraken van de randen, zal ervoor zorgen dat de cellen dicht worden gezaaid en zal snel te bereiken samenvloeiing.
- Bereid een 1,5 mL microfugebuisje per transfectie met 500 ul van EGM2MV media (Lonza) en apart gezet in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
- Los HUVEC met 0,25% trypsine-EDTA en verzamelen in een 15 ml conische buis. Tel de cellen. 5 x 10 5 cellen zijn nodig voor elke transfectie. Pas de celsuspensie volume op een pellet die bevat 5 x 10 5 cellen vermenigvuldigd met het aantal van Transfe verkrijgenCTIES worden uitgevoerd.
- Centrifugeer de celsuspensie in een klinische centrifuge bij 5000 rpm gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant door het kantelen van de buis om zo veel media te verwijderen als mogelijk.
- Resuspendeer de pellet met Basic Nucleofector Solution van ofwel de HUVEC of primaire endotheelcellen Nucleofector Kit (Lonza). Gebruik 100 ul per 5 x 10 5 cellen. Als gevolg van de toxiciteit van deze oplossing, is het belangrijk om snel te werken, terwijl de cellen worden gesuspendeerd in deze oplossing.
- Voeg de GFP-β-actine vector plasmide (0.2-2 pg per 100 ul van Nucleofector schorsing) om de transfectie monster. 0,2-2 ug van GFP-actine-plasmide DNA per 5 x 10 5 cellen per transfectie.
- Breng 100 pi celsuspensie om een Nucleofector Cuvette. Deksel en tik op de cuvette een paar keer om de celsuspensie zorgen is helemaal naar de bodem.
- Plaats de cuvette in de Nucleofector II apparaat kuvet slot en voer de desired elektroporatie programma. We maken gebruik van het programma A-034 voor HUVEC.
- Ga terug de cuvet naar de biologische veiligheid kap. Breng een van de microfugebuizen buizen uit de 37 ° C incubator die 500 pi van EGM2MV bevat aan de kap. Met behulp van een van de overdracht pipetten die in de Nucleofector kit, voeg de warme 500 pi van media om de celsuspensie in de cuvet. Overdracht van al de inhoud van de cuvet terug naar de microfugebuis en plaats in de incubator gedurende 15 minuten. om de cellen te herstellen.
- Herhaal stap 9-11 indien nodig als er meer cellen worden getransfecteerd.
- Een microfugebuis met 600 ul van getransfecteerde HUVEC suspensie kan worden gezaaid op twee dekglaasjes. Onder de motorkap en met een 1000 il micropipet, zacht pipet op en neer een keer om de opschorting mix, en dan plaats 300 pi van de suspensie direct op een gelatine-gecoat dekglaasje aan. Laat niet de vering tegen de rand van het dekglaasje aan. Plaats in de 37 ° C / 5% CO 2
- Na de 1-4 h, inspecteren de getransfecteerde cellen om te bevestigen dat zij hebben gehecht aan het dekglaasje aan. Voeg vervolgens 10 ml van EGM2MV media, en keer terug naar de plaat van de 37 ° C / 5% CO 2 incubator. GFP-actine expressie kan doorgaans worden waargenomen binnen 4-8 uur. Experimenten worden meestal uitgevoerd binnen 24-48 uur
2. Het instellen van de live-cell imaging kamer en het podium verwarming
- Voor de meeste van onze onderzoeken, hebben we gebruik gemaakt van een Warner Instruments open ruitvormige bad (RC22) die in een PH-1 fase verwarming, gevoed door een zwaartekracht systeem. Toch zijn er verschillende opties zijn beschikbaar voor live cell imaging stadia, met inbegrip van kamers die met glazen bodem kweekschalen, open versus gesloten kamers, en diverse microincubator / doelstelling verwarming combinaties en grote incubator systemen tegemoet te komen. Uiteindelijk zal de kamer selectie hangt af van factoren, waaronder de noodzaak om het bad de toegang tot een test agent of medicijnen toe te voegen, wheis er het medium zal zijn statisch of onder stroom, en de lengte van het experiment. Daarnaast, soms factoren als temperatuur instabiliteit kan veroorzaken richten drift, en kan worden geminimaliseerd door systemen die stabiel bad en objectieve temperaturen kan handhaven.
- Aliquot genoeg medium voor het experiment. We aliquot 50 ml albumine fysiologisch zout-oplossing (APSS, tabel 1) voor elk uur van het experiment zal duren.
- Ofwel een pomp of gravity-flow-systeem kan worden gebruikt om medium te leveren aan de kamer. Voor ons systeem, voegen we APSS aan een eenvoudige zwaartekracht-flow systeem opgebouwd uit een intraveneuze lijn stroom, aangesloten op een inline heater (Warner Instruments model SH-27A). We passen debiet bij ongeveer 40 ml / h.
- Als een open bad kamer als de onze zal worden gebruikt, gelden vacuüm vet aan op de buitenste rand aan de onderkant van de diamant bad en met een wattenstaafje. Vervolgens krijgen we een cel bedekte dekglaasje uit de couveuse, en til het dekglaasje met behulp van pincet. Gently contact met de achterkant naar een kimwipe om te genieten van overtollige medium terwijl de cel-bedekte zijde nat. Met de cellen open, plaats de diamant bad over het dekglaasje naar een kamer te vormen.
- Plaats snel de kamer in het podium verwarming en de klemmen met de hand draai op de kamer. Een groot probleem in deze fase is de mogelijkheid dat de cellen uitdrogen. Daarom is het belangrijk om snel te werken en als je klaar bent, onmiddellijk pipet ~ 1 ml medium in de kamer om de cellen te voorkomen dat uitdroogt.
- Onze kamer maakt gestage stroom van het medium over de cellen. Net voor het inschakelen van stroom, is het belangrijk om een vacuum slang hechten aan de houder op de kamer om af te sluiten van overtollige kweekmedium (APSS) toe te staan. De inline heater en bad verwarming moet ook worden aangezet een dit punt (tot 37 ° C). Ons systeem heeft ook een thermistorsonde om de temperatuur, die moet worden gelegd op de rand van het bad.
- Veeg voorzichtig de onderkant van de coverslip met een kimwipe doorweekt met 70% EtOH om de resterende EGM2MV media en zout opbouw te verwijderen. Veeg een tweede keer met een droge kimwipe of lens papier.
- Nadat de kamer is ingesteld, stroom is ingeschakeld, en de temperatuur is stabiel op 37 ° C, laat de cellen ten minste 30 minuten aan te passen en te stabiliseren voordat het experiment.
- Tijdens het wachten, zet op alle componenten van de live-cell imaging microscoop (lampen, filter wiel controller, camera, computer).
3. Overname van gegevens met live-cell imaging microscoop
- Diverse live-cell microscopie systemen zijn beschikbaar. Ons systeem is een Nikon Eclipse TE-2000U met de volgende onderdelen:
- Sutter Instrumenten Lambda LS 300 W xenon lamp
- Sutter Instrumenten Lambda 10-3 excitatiefilter wiel met SmartShutter en S492 filter (D350 en S572 exciter filters zijn ook beschikbaar voor UV en RFP toepassingen)
- Dichroic 2002bs emitter (Nikon 61002m)
- CI Plan Fluor 10X DLL Doelstelling, NA 0,30 (Nikon MRH10100)
- Plan Fluor ELWD 40X DM Doelstelling, NA 0,60 (Nikon MRH08420)
- Plan Apo VC 100X Oil Doelstelling, NA 1,40 (Nikon MRD01901)
- Lichttechniek CoolSNAP HQ2 camera, 1392 x 1040 imaging matrix, 6,45 x 6,45 micrometer pixels
(Roper Scientific) - We hebben ook twee software pakketten die gebruikt kunnen worden voor beeld acquisitie. Nikon Elements-AR 3.0, en 6.1 Metamorph.
- Na het bekijken van de cellen en het vinden van een geschikte ruimte voor studie, vergrendel de grove scherpstelling knop en controleer de aanschaf van software zo hebt ingesteld dat:
- Het filter wiel is ingesteld voor de S492 filter (met het label "FITC" in onze configuratie)
- In de overname-software, is de doelstelling om de gewenste vergroting (onze microscoop is niet gemotoriseerd, maar dit stelt de micrometer / pixel ratio) wedstrijd. Ook voor zorgen dat de optivar lens op de microscoop is ingesteld op 1,0 x vergroting. Instellen van de optivAR naar 1.5X kunnen verhogen vergroting, maar ten koste van het verliezen van het signaal intensiteit.
De vergroting te gebruiken hangt af doelstellingen van de studie. Voor de beste detail, zal een 100x objectief met een hoge numerieke apertuur de beste ruimtelijke resolutie en de transmissie van het signaal. Onze microscoop is ook uitgerust met een lange werkafstand 40X doel bestemd is voor een andere toepassing die de extra afstand vereist. Dit kan echter objectief handig zijn als we willen tegelijkertijd meerdere cellen te observeren, en werkt prima voor het bekijken van organel-sized structuren, maar tegen een kostprijs van het verliezen van ruimtelijke resolutie en intensiteit van het signaal. Voor elke studie waarin het signaal intensiteit is een eindpunt, of voor meer geavanceerde beeldvormende technieken, zoals fluorescentie microscopie spikkel, is een 100x objectief aan te bevelen. - De belichting wordt ingesteld tussen de 0,5 tot 2 s. Dit is afhankelijk van de GFP-actine-intensiteit in de cellen. We gebruiken over het algemeen het laagst mogelijke blootstelling tijd om te voorkomen dat bleaching van de GFP-actine en mogelijke toxiciteit voor de cellen.
- Om de beste resolutie, moet de binning worden vastgesteld op 1 x 1 en Winst bij 1. In sommige gevallen hebben wij binning tot 2 x 2 om de blootstelling te verminderen, maar dit vermindert de nauwkeurigheid van de metingen kunnen we over het verplaatsen van objecten in de time-lapse studie.
- Het configureren van de time-lapse instellingen:
- Kies de map waarin u de vastgelegde beelden op te slaan en een bestandsnaam type.
- Stel het aantal beelden en de duur interval tijden voor het experiment. We gebruiken meestal een 15 s tot 1 min interval tussen de beelden en tot 2 uur voor de duur.
- Zorg ervoor dat de actieve sluiter is ingesteld om te worden gesloten tussen acquisities.
- Voordat u begint met time-lapse beeldacquisitie, schakelt u verlichting in de kamer en het veroveren van een enkel beeld om de instellingen te controleren.
- Ook het veroveren van een helderveld beeld. Zorg ervoor dat de condensor is ingesteld op de juiste fase of DIC filter. Zetde halogeenlamp en het verzamelen van de afbeelding. Schakel de halogeen lamp.
- Terug terug naar "FITC" instellingen voor de time-lapse imaging en het veroveren van een testbeeld.
- Vastleggen van de time-lapse-serie.
Tijdens het experiment, is het belangrijk om de beelden te controleren zoals ze zijn verworven. In sommige gevallen kleine veranderingen in temperatuur in de kamer kan concentreren drift. Dit kan vermeden worden door het optimaliseren van de instroom en vacuüm lijnen zodat doorstroming is stabiel over de cellen. Ook kan het minimaliseren van het verkeer in microscoop kamer, en om te buigen tocht van het plafond ventilatieroosters uit de buurt van de microscoop nuttig zijn. Een alternatief dat goed heeft gewerkt in onze ervaring is het gebruik van 37 ° C / 5% CO 2 incubator kamers die het hele podium en objectief te voegen. Deze bieden het voordeel van controle cellen 's nachts of langer, maar de toegang tot de cellen is beperkt.
Indien nodig, pauze van de time-lapse acquisitie en heroriënteren het beeld. Voer de zo snel mogelijk te heroriënteren naar voorkomen dat het veranderen van de tijdsinterval tussen beelden. - Een typische protocol zal bestaan uit 20-30 minuten van de baseline-beelden voor het toevoegen van een test-agent, gevolgd door 0,5 tot 4 uur extra afbeelding acquisitie. De lengte van het experiment kan worden beperkt door fotobleken van de GFP loop van de tijd, dat is waarom het belangrijk is om te kiezen voor de kortste belichtingstijd mogelijk. Het kan ook wenselijk zijn om de interval tussen de tijd die verstrijkt afbeeldingen te wijzigen op 30-60 s, indien een langere studie gewenst is.
4. Data-analyse
- Verschillende software pakketten kunnen worden gebruikt om het beeld sets, zoals NIS Elements, Metamorph, Slidebook, etc. te analyseren we meestal uit te voeren naar ons beeld analyse met behulp van NIH ImageJ mogelijk maken van analyse op een computer in ons lab of thuis. De versies die we gebruiken zijn:
MBF ImageJ ( http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ )
FIJI (i "target =" _blank "> http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji). - ImageJ kan worden gebruikt om een groot aantal dynamische processen, waaronder analyseren:
- Frequentie van lamellipodia uitsteeksels
- Afstand, tijd, en de snelheid van uitsteeksels
- Actine vezels beweging na verloop van tijd
- In ImageJ, wanneer zal de knop het slice / totaal aantal plakjes opent wordt weergegeven in de linker bovenhoek van het venster, samen met de bestandsnaam, het aantal pixels, file type en grootte. De Z scrollbar op de bodem komt overeen met de tijd. Bovendien zullen zweven de aanwijzer op de afbeelding weer te geven van de x-, y-en z pixel locatie aan de onderkant van de ImageJ werkbalk.
- Lamellipodia uitsteeksel kan worden bestudeerd door het bepalen van het aantal nieuwe uitsteeksels in de tijd. Dit kan gedaan worden voor de gehele omtrek cel of een geselecteerde regio. Dit type analyse kan ook worden uitgevoerd in nonconfluent, ongetransfecteerde cellen met fase-contrast of DIC microscopie. Echter, met behulp van cellen die GFP-actine maakt analyse van de samenvloeiing monolagen, in het bijzonder wanneer de cellen met en zonder GFP-actine liggen naast elkaar.
- Lamellipodia uitsteeksel afstand, persistentie (tijd), en de snelheid kan worden beoordeeld door kymograaf (lijn scan) analyse. Teken een lijn loodrecht op de rand van een cel (dit is het makkelijkst als er geen aangrenzende cel, of de aangrenzende cel niet uitdrukken GFP-actine). In ImageJ, op "/" zal een kymograaf, met de x-as die distance en de y-as die tijd (15 s tot 1 min per pixel op basis van de tijdsinterval richtlijnen hierboven). Lijnen kunnen worden getrokken over een uitstekende lamellipodia en de doos afmetingen gemeten (door het indrukken van M in ImageJ). De afstand, tijd en snelheid kan dan worden berekend.
- De beweging van stress vezels kan ook worden gemeten door kymograaf analyse in een soortgelijke manier.
5. Representatieve resultaten:
Met onze transfectie-protocol, we meestal zien expressie van GFP-actine in ten minste 50% van de getransfecteerde HUVEC, en vaak kunnen vinden gebieden op de dekglaasje, waar> 90% van de HUVEC in de regio express GFP-actine. Een voorbeeld van een live-cell imaging experimenteren met subconfluent HUVEC uiten van GFP-actine is te zien in Movie 1. Voor dit bijzondere experiment werd een beeld eenmaal verkregen per minuut. Zoals te zien is in de film, GFP-actine in de HUVEC kan worden waargenomen door het cytoplasma, evenals in draadvormige structlen en in de lokale lamellipodia uitsteken langs de cel rand. Ook tot uiting in de film is dat GFP-actine meningsuiting niet uniform tussen de cellen. Cellen gekozen voor studie hebben meestal genoeg GFP-actine aanwezig om de verschillende structuren die filamenteuze actine te visualiseren. Cellen die een zeer hoge niveaus van GFP-actine kan problematisch zijn voor de studie, omdat in deze cellen is het meestal moeilijk om F-actine structuren te onderscheiden van de grote hoeveelheid G-actine aanwezig.
Movie 2 toont een voorbeeld van het gedrag van de samenvloeiing HUVEC uiten van GFP-actine. Net als de subconflent HUVEC, actieve lamellipodia vorming en de omzet langs de randen van de cellen was duidelijk. Echter, deze lamellipodia vaak aanleiding gaf tot membraan ruches, wat aangeeft minder efficiënt uitsteeksel 7. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van aangrenzende cellen het blokkeren van de nabijgelegen substraat. Actine corticale vezels en stress vezels zijn ook zichtbaar in Movies 1 en 2. Hoewel de cellen we oBServed stationair gebleven, de stress vezels zijn vergelijkbaar met dwarse boog vezels in migrerende cellen, de vorming van de buurt van de cel rand en bewegen zijwaarts in de richting van de cel, waar ze uit elkaar te halen 8, 9. Een extra dynamische functie waargenomen in deze cellen was de formatie van actine ring structuren die concentrisch uitgebreid, voorheen genaamd actine wolken 10.
Een voorbeeld van hoe de afstand, doorzettingsvermogen, en de snelheid van de cel uitsteeksels zijn gekwantificeerd van deze time-lapse image sets met behulp van kymograaf analyse is weergegeven in figuur 1. In figuur 1A, is een enkele pixel lijn ongeveer loodrecht op de rand cel voor het genereren van een kymograaf (Figuur 1B). In deze kymograaf, is het gebied bepaald door de lijn verticaal geplaatst en de beelden uit de hele time-lapse worden horizontaal gestapeld. Kijkend van links naar rechts in de kymograaf, zijn uitsteeksels voorgesteld als opwaartse bewegingen in de rand van de cel. In figuur 1C, een lijn was superimposed aan de rand van een van deze uitsteeksels, en de pixel-gegevens gekoppeld aan die lijn werden verzameld en worden getoond in het venster Resultaten aan de onderzijde van het paneel. Deze analyse maakt kwantificering van uitsteeksel dynamiek, en kan ook gebruikt worden om de uitstulping frequentie (het aantal uitsteeksels / tijd) schatten in deze regio van de cel.
Een voorbeeld van de analyse van stress vezels beweging is weergegeven in figuur 2. De meeste stress-vezels zagen we vormden de buurt van de cel periferie en liep naar de cel centrum, waar ze uiteindelijk uit elkaar gehaald. Dit kan ook worden gekwantificeerd door kymograaf analyse. Een lijn is loodrecht op de cel rand en om de stress vezels (figuur 2A) en een kymograaf is gegenereerd (figuur 2B). De stress vezels worden weergegeven als ononderbroken lijnen in het cytoplasmatische gebied in de kymograaf, vaak naar beneden en naar rechts (in de richting van de cel centrum). Soms zijn de vezels zijn moeilijk te zien in de oorspronkelijke kymograaf, en in deze gevallen hebben wegebruik van het filter Onscherp masker om het beeld (figuur 2C) te scherpen. Lijnen worden getekend op de stress vezels en de pixel gegevens worden verzameld met behulp van de maatregel functie (figuur 2D). Een alternatieve manier om deze gegevens te verzamelen is om een lijn te trekken vanaf het begin tot het einde van de geïdentificeerde spanning fiber to the gemiddelde helling te krijgen voor de duur dat de vezel werd waargenomen (figuur 2E). Deze analyse maakt kwantificering van stress vezels laterale beweging en kan ook worden gebruikt om het aantal van stress vezels waargenomen in deze regio van de cel te kwantificeren.
Figuur 1. Kymograaf analyse van de cel rand aan het uitsteeksel afstand, persistentie, en de snelheid van de lokale lamellipodia te bepalen. A. Een enkele pixel lijn is ongeveer loodrecht op de rand van de cel. Deze regio wordt gewonnen uit elk beeld van de time-lapse ingesteld om een montage van de regio's op termijn te genereren. B. In ee als gevolg kymograaf, de x-as de tijd, het verplaatsen van links naar rechts, en de y-as afstand. Beweging van de cel rand na verloop van tijd kan worden geëvalueerd in deze kymograaf, en lamellipodia zijn geïdentificeerd regio's waar de cel rand, verplaatsen naar rechts, gaat omhoog. C. Een lijn is getrokken op de cel rand waar een uitsteeksel van een lamellipodium is geïdentificeerd. De afmetingen van de begrenzende rechthoek voor de getrokken lijn worden dan verworven (getoond in op elkaar venster). De breedte wordt gebruikt om het uitsteeksel tijd of persistentie te berekenen. De hoogte wordt gebruikt om het uitsteeksel afstand te berekenen. Het uitsteeksel snelheid wordt berekend door de hoogte van de breedte. In dit voorbeeld is de opwaartse afstand was 96 pixels x 0,16125 micrometer / pixel = 15,5 micrometer, en de tijd was 11 pixels x 1 min. / pixel = 11 minuten. De snelheid werd berekend als 15,5 μm/11 min. = 1,4 micrometer / min.
Figure 2. kymograaf analyse van de beweging van actine stress-vezels. A. Een enkele pixel lijn loodrecht op de rand van de cel naar een kymograaf genereren. B. Zoals getoond in Fig. 1, in de daaruit voortvloeiende kymograaf, de x-as de tijd en de y-as afstand. Stress vezels worden waargenomen als doorlopende lijnen in de cel, vaak gaan naar beneden en naar rechts (pijlen) C. Om beter te visualiseren de stress vezels, kan het filter Onscherp masker gebruikt worden. In dit voorbeeld werd een straal van 3 pixels en masker gewicht van 0,60 gebruikt. D. Enkele pixel lijnen worden vervolgens getrokken over de gesignaleerde spanning vezel, en gegevens verzameld. In dit paneel drie lijnen werden getrokken en vervolgens op "delete" is ingedrukt om een permanente annotatie (witte lijn) van hun locaties te maken na elke meting. E. Als alternatief, wanneer de gemiddelde afstand, tijd, en de snelheid van de stress vezel gewenst is, kan een lijn worden getrokken uit de start en finish punten (gele lijn), en de gegevens voorr dat kan worden verworven (gemarkeerd in het venster Resultaten). Voor dit voorbeeld, zijn de metingen die op dit stress-vezel voor 37 frames x 1 frame / min. = 37 minuten. De afgelegde afstand in deze periode was 75 frames x 0,16125 micrometer / pixel = 12,1 micrometer. De resulterende zijdelingse snelheid van de stress vezel werd 12,1 μm/37min = +0.33 um / min. Een positieve waarde voor de snelheid wordt toegekend voor vezels het verplaatsen in de richting van de cel centrum, en negatief voor het verplaatsen in de richting van vezels in de periferie.
Film 1. Time-lapse beelden van de live HUVEC uitdrukken GFP-actine. Het interval tussen de beelden is 1 minuut. Lokale lamellipodia staken langs de gehele omtrek van de cellen. Daarnaast, dwarse boog stress-vezels verplaatst lateraal in de richting van het centrum van de cellen. Wanneer trombine (1 U / ml) werd toegevoegd aan het bad, de cellen gecontracteerd lichtjes en de uiterlijke uitsteeksels van lamellipodia onderbroken voor ongeveer 10 minuten. Nadat de cellen gecontracteerd, lamellipodia vorming en de omzet te hervatten d. Klik hier om de film te bekijken.
Movie 2. Confluent HUVEC uiten van GFP-actine, voor en na de behandeling met trombine. Verstreken tijd wordt weergegeven in de rechter benedenhoek als minuten: seconden. Het interval tussen de beelden is 30 s. Trombine (1 U / ml) werd toegevoegd na de 45 minuten. baseline periode. Geannoteerde gebeurtenissen omvatten de lokale lamellipodia vorming en de omzet (pijlpunten buurt van een mobiele randen, 00:59 - 37:29), actine wolken (pijlen, 01:59 - 21:29), en een gat in een tricellular kruispunt dat verwijdt na thrombine wordt toegevoegd (pijl, 62:30 - 70:00). Dwarse boog stress-vezels zijn ook tot uiting in een aantal van de cellen. De cellen worden weergegeven actieve vorming en de omzet van de lokale lamellipodia langs de randen, met vele die aanleiding geven tot membraan ruches. Trombine veroorzaakte een pauze in lamellipodia vorming en de omzet, en de korte verschijning van een aantal kleine openingen tussen de cellen.http://www.jove.com/files/ftp_upload/3187/Movie2-confluentHUVEC.avi "> Klik hier om de film te bekijken.
Discussion
De beeldvorming van GFP-actine in levende endotheelcellen in staat stelt een gedetailleerde analyse van de dynamica van het actine cytoskelet in reactie op inflammatoire stimuli. Deze methode kan ook nuttig zijn om voort te bouwen op eerdere bevindingen met herinrichting van het cytoskelet in reactie op de fysieke krachten als shear stress 11. Daarnaast is deze methode laat een gedetailleerde beoordeling van de bijdrage van actine cytoskelet dynamiek verschillende endotheelcellen activiteiten, waaronder migratie, mitose, de vorming van intercellulaire kruispunten en junctional rijping, en het onderhoud van de barrièrefunctie.
In de getoonde gegevens kunnen het gedrag van de endotheel-actine cytoskelet in acht worden genomen voor en na behandeling met trombine. Lokale lamellipodia langs de randen van endotheliale cellen waargenomen vormen en achteruit in de tijd zowel nonconfluent en confluente cel monolagen. De behandeling met trombine kort onderbroken lamellipodia vormatie en omzet. Trombine veroorzaakte ook de cellen iets contract, in overeenstemming met eerdere rapporten die trombine actine stress-vezels vorming en een verhoogde spanning centripetale ontwikkeling in de endotheelcellen 12-14 veroorzaakt. Echter, van live cell imaging studies zoals deze, kan de oorsprong van de stress-vezels nu worden bepaald. In de HUVEC, de meeste van de stress vezels afkomstig van de cel periferie en lijken op dwarse boog vezels in migrerende cellen 8, 9. Een ander sterk punt van deze methode boven het gebruik van vaste cellen is dat het aantal van stress vezels kan worden gekwantificeerd in individuele cellen voor en na de behandeling trombine, waardoor selectie bias tussen de experimentele groepen.
Met dit protocol evalueren we dynamische beweging van de cel rand en actine stress-vezels. Om actine monomeer dynamiek te begrijpen in endotheelcellen, meer geavanceerde technieken, zoals fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) of fluorescentie speckle microskopie (FSM) kan worden toegepast 15, 16. Bovendien, omdat microvasculaire endotheelcellen kunnen een beter model van microvasculaire barrièrefunctie, de optimalisering van transfectie protocollen om effectief GFP-actine uit te drukken in microvasculaire endotheelcellen vertegenwoordigt een logische toekomstige richting.
In het kort, imaging van levende endotheliale cellen die GFP-actine vormt een krachtig instrument om te bepalen hoe de endotheelcellen actine cytoskelet reageert op verschillende soorten stimuli. Studies met behulp van goed samenvloeiing endotheliale monolagen zal helpen bij het bepalen van de rol van dynamische structuren zoals actine-rijke lamellipodia en dwars boog stress-vezels in endotheel barrièrefunctie. Daarnaast zal live cell imaging van endotheliale cellen die GFP-actine of andere fusie-eiwitten die visualisatie van andere subcellulaire structuren in staat te stellen die nodig zijn tijdruimtelijke gedetailleerde informatie om de signalering en structurele mechanismen te begrijpen dat determine barrière integriteit.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De GFP-β-actine plasmide werd rijkelijk verzorgd door dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Afdeling Pathologie, en werd versterkt in het laboratorium van Dr Becky Worthylake, LSUHSC-NO afdeling Farmacologie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (P20 RR-018766) en de American Heart Association (05835386N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Ringer 5x Stock | |||
| Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-3 | 35 g |
| Potassium Chloride | JT Baker | 3040 | 1.75 g |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-3881 | 1.47 g |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M-9397 | 1.44 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 2. MOPS buffer | |||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | 125.6 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS) | |||
| Ringer stock (5x) | N/A | N/A | 200 mL |
| Mops Buffer | N/A | N/A | 5 mL |
| Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S-9638 | 0.168 g |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | 0.22 g |
| EDTA sodium salt | Sigma-Aldrich | ED2SS | 0.0074 g |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | 0.901 g |
| Albumin, Bovine | USB Corp., Affymetrix | 10856 | 10 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Adjust pH to 7.4 at 37°C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C. | |||
| 4. 0.9% Saline | |||
| Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-3 | 9 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 5. 1.5 % Gelatin Solution | |||
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | 15 g |
| 0.9% Saline | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Warm the solution to 37°C to dissolve gelatin sufficiently. While still warm, sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C | |||
References
- Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. Role of GTPases in control of microvascular permeability. Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).
- Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability. Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).
- Yuan, S. Y. Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability. Microcirculation. 7, 395-403 (2000).
- Birukov, K. G. Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier. Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).
- Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. Handbook of Physiology: Microcirculation. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. , 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).
- Hu, Y. L., Chien, S. Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).
- Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization. Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).
- Hotulainen, P., Lappalainen, P. Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells. J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).
- Pellegrin, S., Mellor, H.
- Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A.
- Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells. Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).
- Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction. Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).
- van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ. Res. 87, 335-340 (2000).
- Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).
- Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).
- Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).
