Studie av Actin cytoskelettet i Live endotelceller uttrycka GFP-Actin

Summary

Mikroskopisk avbildning av levande endotelceller uttrycker GFP-aktin gör karaktärisering av dynamiska förändringar i cytoskelettala strukturer. Till skillnad från tekniker som använder fasta prover, ger denna metod en detaljerad bedömning av temporala förändringar i aktin cytoskelettet i samma celler före, under och efter olika fysiska, farmakologiska eller inflammatoriska stimuli.

Abstract

Den mikrovaskulära endotel spelar en viktig roll som en selektiv permeabilitet hinder för vätskor och lösta ämnen. Limmet korsningar mellan endotelcellerna reglera genomsläpplighet av endotel, och många studier har visat det viktiga bidraget från aktin cytoskelettet att bestämma Junktional integritet ^1-5. En kortikala aktin bälte tros vara viktiga för att upprätthålla stabila korsningar ^{1, 2, 4, 5.} Däremot är aktin stressen fibrer tros generera centripetala spänningar inom endotelceller som försvagar korsningar ^2-5. Mycket av denna teori har varit baserad på studier där endotelceller behandlas med inflammatoriska mediatorer kända för att öka endotelceller permeabilitet, och sedan fastställande av celler och märkning F-aktin för mikroskopisk observation. Men dessa studier ger en mycket begränsad förståelse för den roll som aktin cytoskelettet eftersom bilder av fasta celler ger endast ögonblicksbilder itid med någon information om dynamiken i aktin strukturer ^5.

Live-cell imaging gör införlivandet av den dynamiska karaktären hos aktin cytoskelettet i studier av de mekanismer avgöra endothelial barriären integritet. En stor fördel med denna metod är att effekten av olika inflammatoriska stimuli på aktin strukturer i endotelceller kan bedömas på samma uppsättning av levande celler före och efter behandling, ta bort eventuell bias som kan uppstå när observerar fasta prover. Mänskliga navelsträngen ven endotelceller (HUVEC) är transfererats med en GFP-β-aktin plasmid och vuxit till sammanflödet på glas täckglas. Time-lapse bilder av GFP-aktin i konfluenta HUVEC fångas före och efter tillsats av inflammatoriska mediatorer som framkallar tidsberoende förändringar i endotelceller barriär integritet. Dessa studier möjliggöra visuell kontroll av vätska sekvens av förändringar i aktin cytoskelettet som bidrar till endothelial barriär störningar och restaurering.

Våra resultat visar genomgående lokal, aktin-rika lamellipodia bildning och omsättning i endotelceller. Bildandet och transport av aktin stressen fibrer kan också förekomma. En analys av frekvensen av bildning och omsättning av de lokala lamellipodia, före och efter behandling med inflammatoriska stimuli kan dokumenteras genom kymograph analyser. Dessa studier ger viktig information om den dynamiska karaktären av aktin cytoskelettet i endotelceller som kan användas för att upptäcka tidigare okända molekylära mekanismer viktiga för upprätthållandet av endotelceller barriär integritet.

Discussion

Den avbildning av GFP-aktin i levande endotelceller möjliggör en detaljerad analys av dynamiken i aktin cytoskelettet som svar på inflammatoriska stimuli. Denna metod kan också vara bra att bygga vidare på tidigare resultat som visar ombyggnaden av cytoskelettet som svar på fysiska krafter som skjuvspänningen ^11. Dessutom kan denna metod en detaljerad bedömning av bidraget från aktin cytoskelettala dynamik till olika endotelceller aktiviteter, inklusive migration, mitos, bildande av intercellulär korsningar och Junktional mognad, och underhåll av barriärfunktion.

I det visade data, kan beteendet hos de endothelial aktin cytoskelettet observeras före och efter behandling med trombin. Lokala lamellipodia längs kanterna av endotelceller observerades bilda och gå bakåt med tiden i både nonconfluent och confluent cell monolager. Behandling med trombin avbryts en kort stund lamellipodia formenation och omsättning. Trombin orsakade också cellerna att ingå avtal en aning, i samförstånd med tidigare rapporter om att trombin orsakar aktin bildas stressen fiber och ökad centripetala spänning utvecklingen i endotelceller ^12-14. Men från levande studier cell imaging som denna, kan ursprunget till den stress fibrer nu bestämmas. I HUVEC, de flesta av stress fibrer ursprung i cellen periferin och liknar tvärgående båge fibrer i vandrande celler ^{8, 9.} En annan styrka med denna metod än att använda fasta celler är att antalet av stress fibrer kan kvantifieras i enskilda celler före och efter trombin behandling, vilket eliminerar selektionsfel mellan experimentella grupper.

Med detta protokoll vi utvärderar dynamisk rörelse av cellen kanten och aktin fibrer stress. För att förstå aktin monomer dynamiken i endotelceller, mer avancerade tekniker såsom fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) eller fluorescens fläckar microskopia (FSM) kan tillämpas ^{15, 16.} Dessutom, eftersom mikrovaskulära endotelceller kan utgöra en bättre modell av mikrovaskulära barriärfunktion, optimering av transfektion protokoll för att effektivt uttrycka GFP-aktin i mikrovaskulära endotelceller representerar en logisk framtida inriktning.

Sammanfattningsvis innebär avbildning av levande endotelceller uttrycker GFP-aktin ett kraftfullt verktyg för att bestämma hur endotelceller aktin cytoskelettet svarar på olika typer av stimuli. Studier med tätt konfluenta endothelial monolager kommer att avgöra vilken roll dynamiska strukturer som aktin-rika lamellipodia och tvärgående båge fibrer stress i endotelial barriärfunktion. Dessutom kommer levande cell imaging av endotelceller uttrycker GFP-aktin eller andra proteiner fusion som möjliggör visualisering av andra subcellulära strukturer ge detaljerad Spatiotemporal information som behövs för att förstå signal-och strukturella mekanismer som determine barriär integritet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Ringer 5x Stock
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	JT Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
2. MOPS buffer
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma-Aldrich	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma-Aldrich	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB Corp., Affymetrix	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37°C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C.
4. 0.9% Saline
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-3	9 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
5. 1.5 % Gelatin Solution
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	15 g
0.9% Saline	N/A	N/A	Bring to 1 L
Warm the solution to 37°C to dissolve gelatin sufficiently. While still warm, sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C