Undersøgelse af Actin cytoskeleton i Live endoteliale celler, der udtrykker GFP-Actin

Summary

Mikroskopisk billedbehandling af levende endothelceller udtrykker GFP-aktin tillader karakterisering af dynamiske ændringer i cytoskeletal strukturer. I modsætning til teknikker, der anvender faste prøver, giver denne metode en detaljeret vurdering af tidsmæssige ændringer i actin cytoskeleton i de samme celler før, under og efter forskellige fysiske, farmakologiske eller inflammatoriske stimuli.

Abstract

Det mikrovaskulære endothelium spiller en vigtig rolle som et selektivt permeabel barriere for væsker og opløste stoffer. Limen kryds mellem endotelceller regulere permeabilitet endotelet, og mange undersøgelser har vist det vigtige bidrag actin cytoskeleton at afgøre Junctional integritet ^1-5. En cortical aktin bælte menes at være vigtigt for opretholdelsen af stabile vejkryds ^{1, 2, 4, 5.} I modsætning hertil er actin stress fibre menes at generere centripetale spændinger i endotelceller, der svækker vejkryds ^2-5. Meget af denne teori er baseret på studier, hvor endothelceller behandles med inflammatoriske mediatorer kendt for at øge endotel permeabilitet, og derefter om fastsættelse af celler og mærkning af F-aktin til mikroskopisk observation. Men disse undersøgelser giver en meget begrænset forståelse af den rolle, de actin cytoskeleton fordi billeder af faste celler giver kun snapshots itid sammen med nogen oplysninger om dynamikken i aktin strukturer ^5.

Live-cell imaging tillader inkorporering af den dynamiske karakter af actin cytoskeleton ind i studier af de mekanismer, der tjener endothelial barriere integritet. En stor fordel ved denne metode er, at effekten af ​​forskellige inflammatoriske stimuli på aktin strukturer i endotelceller kan vurderes i det samme sæt af levende celler før og efter behandlingen, at fjerne potentielle bias, som kan opstå, når observere faste prøver. Menneskelige navlestrengen vene endotelceller (HUVEC) er transficeret med et GFP-β-aktin plasmid og vokset til sammenløbet på glas dækglas. Time-lapse billeder af GFP-actin i sammenflydende HUVEC er fanget før og efter tilsætning af inflammatoriske mediatorer, der kan udløse tidsafhængige ændringer i endothelial barriere integritet. Disse undersøgelser muliggøre en visuel observation af væsken sekvens af ændringer i actin cytoskeleton, der bidrager til endothelial barriere forstyrrelser og restaurering.

Vores resultater viser konsekvent lokale, aktin-rige lamellipodia dannelse og omsætning i endothelceller. Dannelsen og flytning af actin stress fibre kan også ses. En analyse af hyppigheden af ​​dannelse og omsætning af den lokale lamellipodia, før og efter behandling med inflammatoriske stimuli kan dokumenteres ved kymograph analyser. Disse undersøgelser giver vigtige oplysninger om den dynamiske karakter af actin cytoskeleton i endotelceller, der kan bruges til at opdage hidtil uidentificerede molekylære mekanismer vigtige for opretholdelsen af ​​endothelial barriere integritet.

Protocol

1. Transfektion af HUVEC med GFP-aktin

1. Forskellige metoder kan bruges til at transfect HUVEC. Vores lab bruger Nucleofector system (Lonza, Basel Schweiz) skitseret nedenfor. Generelt arbejde hurtigt for at forbedre cellernes levedygtighed og transfektion effektivitet. Hver transfektion kræver 5 x 10 ⁵ HUVEC, der vil blive seedet på to glas dækglas (Corning nr. 1, 22 x 50 mm). Den Nucleofector kombinerer elektroporation og kemiske reagenser til transfect plasmid DNA, og typisk opnår en> 50% udtryk effektivitet. Kemiske transfektion reagenser er en alternativ metode. En gruppe har med succes transficeret kvæg endotelceller med GFP-aktin med GenePORTER reagens ^6. Den Nucleofector protokol vi bruger er beskrevet nedenfor.
2. Presterilized cultureware eller almindelig dækglas kan bruges, afhængigt af kammeret type. For glas dækglas, sterilisere i et biologisk sikkerhed hætte ved at placere dem i en 10 cm agarpladeindeholder cirka 5 ml 70% ethanol i 2 min. Saml dem op med steril pincet og lufttørre ved at læne dem mod den side af en separat kultur plade.
3. Når tørt, sted hvert dækglas i sin egen 10 cm agarplade. Pipette en 300 μL perle af varm gelatine løsning (1,5% i 0,9% NaCl) på midten af ​​dækglasset og lad det stå i 5 min., Og derefter aspirer. Holde denne matrix belægning i centrum, uden at røre kanterne, vil sikre, at cellerne bliver seedet tæt og vil opnå sammenløbet hurtigt.
4. Forbered en 1,5 ml mikrofugeglas pr transfektion med 500 μL af EGM2MV medier (Lonza) og der er udtaget i et 37 ° C, 5% CO ₂ inkubator.
5. Frigør HUVEC med 0,25% trypsin-EDTA og samle ind i en 15 ml koniske rør. Tælle celler. 5 x 10 ⁵ celler er nødvendige for hver transfektion. Juster cellesuspension volumen til at få en pille, der indeholder 5 x 10 ⁵ celler ganget med antallet af transfeKTIONER, der skal udføres.
6. Centrifuger cellesuspensionen i et klinisk centrifuger ved 5000 rpm i 3 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten ved at vippe røret for at fjerne så mange medier som muligt.
7. Resuspender pellet med Basic Nucleofector Solution fra enten HUVEC eller Primary endotelceller Nucleofector Kit (Lonza). Bruger 100 μL pr 5 x 10 ⁵ celler. På grund af toksicitet af denne løsning, er det vigtigt at arbejde hurtigt, mens cellerne er suspenderet i denne løsning.
8. Tilføj GFP-β-actin vektor plasmid (0,2-2 mg per 100 μL af Nucleofector suspension) til transfektion prøven. 0,2-2 mikrogram GFP-actin plasmid DNA per 5 x 10 ⁵ celler pr transfektion.
9. Overfør 100 μL cellesuspension til en Nucleofector Cuvette. Cover og tryk på kuvetten et par gange for at sikre, at cellesuspensionen er hele vejen til bunden.
10. Sæt kuvetten ind i Nucleofector II enheden kuvetten slot og køre desired elektroporation program. Vi bruger programmet A-034 til HUVEC.
11. Retur kuvetten til den biologiske sikkerhed hætte. Bring en af ​​de mikrofuger rør fra 37 ° C inkubator, der indeholder 500 μL af EGM2MV til emhætten. Ved hjælp af en af ​​overførslen pipetter fastsat i Nucleofector kit, forsigtigt tilføje den varme 500 μL af medier til cellen suspension i kuvetten. Overfør hele indholdet af kuvetten tilbage til mikrofugerøret og sted i varmeskabet i 15 min. at tillade celler til at komme sig.
12. Gentag trin 9-11 efter behov, hvis flere celler er at være transfekteret.
13. Et mikrofugerør indeholdende 600 μL af transficeret HUVEC Suspensionen kan seedet på to dækglas. Under kølerhjelmen, og med en 1000 μL mikropipette, pipette forsigtigt op og ned en gang for at blande suspensionen, og derefter placere 300 μL af suspensionen direkte på en gelatine-belagt dækglas. Lad ikke suspensionen røre ved kanten af ​​dækglasset. Plads i det 37 ° C / 5% CO ₂
14. Efter 1-4 timer, inspicere transficeret cellerne for at bekræfte, at de har knyttet til dækglasset. Derefter tilsættes 10 mL af EGM2MV medier, og vende tilbage til pladen til 37 ° C / 5% CO ₂ inkubator. GFP-aktin udtryk kan typisk ses inden for 4-8 timer. Eksperimenter er typisk udføres inden for 24-48 timer

2. Opsætning af live-cell imaging kammer og scene varmelegeme

1. For de fleste af vores undersøgelser, har vi brugt en Warner Instruments åbne diamantmasker bad (RC22) anbringes i en PH-1 fase varmelegeme, næret af en tyngdekraft flow-system. Men flere muligheder for live cell imaging faser, herunder kamre, der tilgodeser glasbund kultur retter, åben vs lukket kamre, og forskellige microincubator / mål varmelegeme kombinationer og store kuvøse systemer. I sidste ende vil kammeret valg afhænger af faktorer, herunder behovet for at få adgang til badet til at tilføje en test agent eller narkotika, wheDer mediet vil være statisk eller under flow, og længden af ​​eksperimentet. Hertil kommer, faktorer som temperatur ustabilitet til tider kan forårsage fokusere drift, og kan minimeres ved kontrol-systemer, der kan opretholde en stabil bad og objektive temperaturer.
2. Alikvot nok medium for eksperimentet. Vi alikvot 50 ml albumin fysiologisk saltopløsning (APSS, tabel 1) for hver time eksperimentet vil vare.
3. Enten en pumpe eller tyngdekraft-flow-system kan bruges til at levere medium til kammeret. For vores system, tilføjer vi APSS til en simpel tyngdekraft-flow-system opbygget af en intravenøs flow linje, forbundet til en inline varmer (Warner Instruments model SH-27A). Vi anvender flow på omkring 40 ml / h.
4. Hvis en åben bad kammer som vores, vil blive anvendt, gælder vakuum fedt på den yderste kant på undersiden af ​​diamant bad og med en bomulds-spids applikator. Dernæst får vi en celle-dækket dækglas fra rugemaskinen, og forsigtigt løfte dækglasset med en pincet. Gently røre bagsiden til en kimwipe at opsuge overskydende medie og samtidig holde celle-dækket side våde. Med cellerne opad, skal du placere diamant badet over dækglasset til at danne et kammer.
5. Hurtigt sted kammeret ind på scenen varmer og hånd-stramme klemmer over kammeret. En stor bekymring på dette tidspunkt er muligheden for, at cellerne vil tørre ud. Derfor er det vigtigt at arbejde hurtigt, og når du er færdig, straks pipette _~ 1 ml medium i kammeret for at forhindre cellerne i at tørre ud.
6. Vores kammer giver mulighed for jævn strøm af mediet over celler. Lige inden du tænder for strømmen, er det vigtigt at knytte en vakuum slange til holderen på kammeret til at tillade afgangen fra overskydende naeringssubstrat (APSS). Den inline varmelegeme og bad varmelegeme bør også være tændt på dette tidspunkt (til 37 ° C). Vores system har også en termistorsonde til at overvåge temperatur, som bør placeres på kanten af ​​badekarret.
7. Forsigtigt tørre undersiden af ​​den fællesverslip med en kimwipe vædet med 70% EtOH at fjerne de resterende EGM2MV medier og salt oprustning. Tør anden gang med en tør kimwipe eller linse papir.
8. Efter at afdelingen er blevet oprettet, flow er tændt, og temperaturen er konstant ved 37 ° C, giver cellerne i mindst 30 minutter til at justere og stabilisere sig, før du starter eksperimentet.
9. Mens vi venter, skal du tænde alle dele af live-cell imaging mikroskop (lamper, filter hjul controller, kamera, computer).

3. Erhvervelse af data med live-cell imaging mikroskop

1. • Forskellige levende celler mikroskopi systemer er tilgængelige. Vores system er et Nikon Eclipse TE-2000U med følgende komponenter:
   • Sutter Instrumenter Lambda LS 300 W Xenon-lampe
   • Sutter Instrumenter Lambda 10-3 excitation filter hjul med SmartShutter og S492 filter (D350 og S572 impulshjul filtre er også tilgængelige for UV-og RFP applikationer)
   • Dichroic 2002bs emitter (Nikon 61002m)
   • CI Plan Fluor 10X DLL Mål, NA 0,30 (Nikon MRH10100)
   • Plan Fluor ELWD 40X DM Mål, NA 0,60 (Nikon MRH08420)
   • Plan Apo VC 100X Olie Mål, NA 1,40 (Nikon MRD01901)
   • Photometrics CoolSNAP HQ2 kamera, 1392 x 1040 billeddannelse array, 6,45 x 6,45 μm pixels
     (Roper Scientific)
   • Vi har også to software pakker, der kan bruges til billedoptagelse. Nikon Elements-AR 3,0, og Metamorph 6.1.
2. Efter at have set de celler og finde et relevant område for at studere, låse grove fokus knop og kontrollere software erhvervelsen indstillingerne, så:
   1. Filteret Hjulet er sat for S492 filtret (mærket "FITC" i vores konfiguration)
   2. Ved køb softwaren, er det målet at matche den ønskede forstørrelse (vores mikroskop er uden motor, men dette sætter mm / pixel ratio). Sørg også for, at optivar linsen på mikroskop er sat til 1,0 x forstørrelse. Indstilling af optivar til 1,5 x kan øge forstørrelsen dog på bekostning af at miste signal intensitet.
      Forstørrelsen skal anvendes, afhænger formålet med undersøgelsen. For den bedste detalje, vil en 100X mål med en høj numerisk blænde giver den bedste rumlige opløsning og transmission af signalet. Vores mikroskop er også udstyret med en lang arbejdsdag afstand 40X objektiv er beregnet til et andet program, der kræver den ekstra afstand. Dog kan dette mål være nyttigt, når vi ønsker at observere flere celler samtidigt, og virker fint til visning organel-store strukturer, men til en pris for at miste rumlig opløsning og signal intensitet. For enhver undersøgelse, hvor signalet intensitet er et endepunkt, eller til mere avanceret billedbehandling teknikker såsom fluorescens speckle mikroskopi, er et 100X mål anbefales.
   3. Kameraet eksponeringstid ligger mellem 0,5-2 S. Dette afhænger af GFP-actin intensitet i cellerne. Vi plejer at bruge den lavest mulige eksponeringstid for at undgå bleaching af GFP-aktin og potentielle toksicitet til cellerne.
   4. For at opnå den bedste opløsning, skal Binning sættes til 1 x 1 og Gain på 1. I nogle tilfælde har vi indstillet binning til 2 x 2 for at reducere eksponeringen tidspunkt, men der nedsætter præcisionen af ​​de målinger, vi kan gøre på bevægelige objekter i time-lapse undersøgelse.
   5. Konfigurer time-lapse indstillinger:
      1. Vælg den mappe for at gemme det optagne billeder og skriv et filnavn.
      2. Indstil antallet af billeder og interval varighed tider for eksperimentet. Vi bruger typisk en 15 s til 1 min interval mellem billeder og op til 2 timer for varigheden.
      3. Sørg for, at den aktive lukkeren er indstillet til at være lukket mellem akkvisitioner.
3. Før du starter time-lapse billede erhvervelse, skal du slukke det rum, lys og tage et enkelt billede for at kontrollere indstillingerne.
4. Også tage et brightfield billede. Sørg for, at kondensatoren er indstillet til den korrekte fase eller DIC filter. Tændde halogenlampe og indsamle billedet. Sluk for halogenlampe.
5. Vende tilbage til "FITC" indstillinger for time-lapse billedbehandling og tage et test billede.
6. Capture the time-lapse-serie.
   Under eksperimentet, er det vigtigt at overvåge de billeder som de er erhvervet. I nogle tilfælde små ændringer i temperaturen i kammeret kan forårsage fokusere drift. Dette kan undgås ved at optimere tilstrømningen og vakuum linier, således at flowet er stabil over celler. Desuden kan minimere trafikken i mikroskop værelse, og omdirigere træk fra loftet ventilationshuller væk fra mikroskopet være nyttig. Et alternativ, som har fungeret godt i vores erfaring er brug af 37 ° C / 5% CO ₂ inkubator kamre, der omslutter hele scenen og objektive. Disse har den fordel, overvågning celler natten eller længere, men adgangen til cellerne er begrænset.
   Hvis det er nødvendigt, pause time-lapse anskaffelse og koncentrere billedet. Udfør koncentrere sig så hurtigt som muligt at undgå at ændre tidsintervallet mellem billeder.
7. En typisk protokol vil bestå af 20-30 minutter af baseline billeder, før du tilføjer en test agent efterfulgt af 0,5 til 4 timers ekstra billede erhvervelse. Længden af ​​forsøget kan begrænses ved fotoblegning af GFP over tid, hvilket er hvorfor det er vigtigt at vælge den korteste eksponeringstid muligt. Det kan også være ønskeligt at ændre intervallet mellem tidsforskydningen billeder til 30-60 s, hvis en længere undersøgelse er ønsket.

4. Dataanalyse

1. Adskillige software-pakker kan bruges til at analysere billedet sæt, såsom NIS Elements, Metamorph, Slidebook, osv. Vi udfører typisk vores image analyse ved hjælp af NIH ImageJ muliggør analyse på enhver computer på vores laboratorium eller derhjemme. De versioner, vi anvender, er:
   MBF ImageJ ( http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ )
   Fiji (i "target =" _blank "> http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji).
2. ImageJ kan bruges til at analysere mange dynamiske processer, herunder:
   • Hyppighed af lamellipodia fremspring
   • Distance, tid og hastighed fremspring
   • Actin fiber bevægelse over tid
   Nikon Elements sparer time-lapse billeder som et "ND" fil. At åbne i ImageJ det skal konverteres til en TIF-serien ved hjælp af "eksport ND dokument" funktion. Metamorph Billedstakke kan åbnes i ImageJ uden ændringer. En mulighed, vi vælger, når du åbner et TIF-serie i ImageJ er at konvertere til 8-bit gråtoner. Dette gør visning lettere, fordi justeringer af lysstyrke og kontrast vil gælde for hele serien i stedet for enkelt billede, der vises.
3. I ImageJ, hvornår vil det billede, der åbner udsnitsnummer / total skiver blive vist i øverste venstre hjørne af vinduet, sammen med filnavnet, antallet af pixels, filtype og størrelse. Z scrollbar i bunden svarer til tiden. Desuden vil svæver markøren over billedet vise x, y og z pixel placering på bunden af ​​ImageJ værktøjslinjen.
4. Lamellipodia fremspring kan studeres ved at bestemme antallet af nye fremspring over tid. Dette kan gøres for hele cellen omkreds eller et udvalgt område. Denne type analyse kan også udføres i nonconfluent, untransfected celler med fasekontrast eller DIC mikroskopi. Men ved hjælp af celler, der udtrykker GFP-aktin tillader analyse af sammenflydende monolag, især når celler indeholder og mangler GFP-aktin støder op til hinanden.
5. Lamellipodia fremspring afstand, persistens (tid), og hastighed kan blive vurderet af kymograph (linje scanning) analyse. Tegn en linje vinkelret på kanten af ​​en celle (dette er nemmest hvis der ikke er tilstødende celle, eller den tilstødende celle udtrykker ikke GFP-aktin). I ImageJ, at trykke på "/" vil generere en kymograph, med x-aksen repræsenterer distance og y-aksen repræsenterer tid (15 s til 1 min per pixel efter tidsintervallet ovenstående retningslinjer). Linjer kan trækkes over en fremspringende lamellipodia og boksen dimensioner målt (ved at trykke på M i ImageJ). Den distance, tid og hastighed kan derefter beregnes.
6. Bevægelsen af ​​stress fibre kan også måles ved kymograph analyse i en lignende måde.

5. Repræsentative resultater:

Med vores transfektion protokol, vi typisk ser udtryk for GFP-actin i mindst 50% af transficeret HUVEC, og ofte kan finde områder på dækglasset, hvor> 90% af HUVEC i regionen udtrykker GFP-aktin. Et eksempel på en live cell imaging eksperimentere med subconfluent HUVEC udtrykker GFP-aktin er vist i Movie 1. Til netop denne eksperiment, var et billede erhvervet én gang i minuttet. Som det kan ses i filmen, GFP-actin i HUVEC kan ses i hele cytoplasma, såvel som i trådet structstaltninger og i lokale lamellipodia udstående langs cellens kant. Også tydeligt i filmen er, at GFP-aktin udtryk ikke er ensartet mellem celler. Celler udvalgt til undersøgelse typisk har nok GFP-aktin til stede til at visualisere forskellige strukturer, som indeholder filamentøse aktin. Celler, der udtrykker meget høje niveauer af GFP-actin kan være problematisk for at studere, fordi der i disse celler er det typisk vanskeligt at skelne F-aktin strukturer fra den store mængde af G-aktin til stede.

Movie 2 viser et eksempel på den adfærd, sammenflydende HUVEC udtrykker GFP-aktin. Ligesom subconflent HUVEC, var aktiv lamellipodia dannelse og omsætning langs grænserne af cellerne tilsyneladende. Men disse lamellipodia ofte gav anledning til membran flæser, hvilket indikerer mindre effektive protrusion ^7. Dette er formentlig på grund af tilstedeværelsen af ​​tilstødende celler blokerer den nærliggende undergrund. Aktin kortikale fibre og stress fibre er også synlig i Film 1 og 2. Selvom de celler, vi observed forblev stationær, stress fibre ligner tværgående bue fibre for overgangen celler, der danner nær cellens kant og bevæger sig sidelæns mod cellen center, hvor de skilles ad ^{8, 9.} En ekstra dynamisk funktion observeret i disse celler var dannelsen af actin ring strukturer, udvidet koncentrisk, tidligere kaldet aktin skyer ^10.

Et eksempel på, hvordan den afstand, vedholdenhed, og hastigheden af ​​celle fremspring kvantificeres fra disse time-lapse billede, sæt med kymograph analyse er vist i figur 1. I figur 1A, er en enkelt pixel linje trukket nogenlunde vinkelret på cellens kant til generering af et kymograph (Figur 1B). I denne kymograph, er den region defineret af linjen er placeret lodret, og billeder fra hele den time-lapse er stablet vandret. Ser fra venstre mod højre i kymograph er fremspring repræsenteret som opadgående bevægelser i kanten af ​​cellen. I figur 1C, var en linje superimposed på kanten af ​​en af ​​disse fremspring, og pixeldataene forbundet med denne linje blev indsamlet og vises i vinduet Søgeresultater i bunden af ​​panelet. Denne analyse giver mulighed for kvantificering af fremspring dynamik, og kan også bruges til at estimere protrusion hyppighed (antal fremspring / tid) i denne region af cellen.

Et eksempel på en analyse af stress fiber bevægelse er vist i figur 2. De fleste stress fibre vi observerede dannet i nærheden af ​​cellen periferien og flyttede mod cellen centrum, hvor de til sidst skilles ad. Dette kan også kvantificeres ved kymograph analyse. En linie tegnes vinkelret på cellens kant og til stress fibre (Figur 2A) og en kymograph genereres (figur 2B). Den stress fibre vises som kontinuerlige linjer i cytoplasmatisk område i kymograph, ofte bevæger sig ned og til højre (mod cellen i midten). Nogle gange fibrene er svære at se i den oprindelige kymograph, og i disse tilfælde har vianvende Uskarp maske filter til at gøre billedet skarpere (Figur 2C). Linjerne er trukket på stress fibre og de pixel data er indsamlet ved hjælp af foranstaltningen funktionen (Figur 2D). En alternativ måde at indsamle disse data er at trække en linje fra start til slut af de identificerede stress fiber for at få den gennemsnitlige hældning for varigheden, at fiber blev observeret (Figur 2E). Denne analyse giver mulighed for kvantificering af stress fiber lateral bevægelse og kan også bruges til at kvantificere antallet af stress-fibre observeret i denne region af cellen.

Figur 1. Kymograph analyse af cellens kant til at bestemme protrusion afstand, vedholdenhed, og hastigheden af lokale lamellipodia. A. En enkelt pixel streg nogenlunde vinkelret på kanten af ​​cellen. Denne region er udvundet fra hvert billede af time-lapse indstillet til at generere en montage af regionen over tid. B. I the resulterende kymograph, x-aksen repræsenterer tid, bevæger sig fra venstre mod højre, og y-aksen viser afstand. Flytning af cellens kant over tid kan blive evalueret i denne kymograph, og lamellipodia er identificeret områder, hvor cellens kant, flytter mod højre, går opad. C. En linie er trukket på cellens kant, hvor et fremspring af en lamellipodium er blevet identificeret. Dimensionerne i den omgivende rektangel til den aftegnede linje er derefter erhvervet (vist i overlejret vindue). Bredden er anvendt til at beregne protrusion tid eller vedholdenhed. Højden er brugt til at beregne protrusion afstand. Det fremspring hastighed beregnes ved at dividere højden ved bredden. I dette eksempel blev den opadgående afstanden 96 pixel x 0,16125 mm / pixel = 15,5 μm, og tiden var 11 pixel x 1 min. / pixel = 11 min. Hastigheden blev beregnet som 15,5 μm/11 min. = 1,4 mm / min.

FIGUR 2. Kymograph analyse af flytning af aktin stress fibre. A. En enkelt pixel linje tegnes vinkelret på kanten af cellen til at generere en kymograph. B. Som vist i Fig. 1, i den resulterende kymograph repræsenterer x-aksen tid og y-aksen afstand. Stress fibre er observeret som kontinuerlige linjer i cellen, ofte går nedad og til højre (pile) C. For bedre at kunne visualisere den stress fibre, kan filtret Uskarp maske anvendes. I dette eksempel, var en radius på 3 pixels og maske vægt på 0,60 anvendes. D. Enkelt pixel linjer derefter trækkes over identificerede stress fiber, og data indsamles. I dette panel tre linier blev trukket og derefter "slet" blev presset til at lave en permanent anmærkning (hvid linje) af deres placeringer efter hver måling. E. Alternativt, hvis den gennemsnitlige distance, tid og hastighed af stress fiber ønskes, kan en streg fra start og slut punkter (gul linje), og data forr, der kan erhverves (fremhæves i Resultater vindue). I dette eksempel blev måling foretaget på denne stress fiber for 37 frames x 1 frame / min. = 37 min. Den strækning, der i løbet af denne periode var 75 frames x 0,16125 mm / pixel = 12,1 μm. Den resulterende laterale Hastigheden af ​​stress fiber var 12,1 μm/37min = 0,33 mm / min. En positiv værdi for hastighed er tildelt til fibre bevæger sig mod cellen centrum, og negativ for fibre bevæger sig mod periferien.

Movie 1. Time-lapse billeder af levende HUVEC udtrykker GFP-aktin. Intervallet mellem billeder er 1 min. Lokale lamellipodia stak langs hele kanten af ​​celler. Hertil kommer, flyttede tværgående bue stress fibre sideværts mod midten af ​​celler. Da trombin (1 E / ml) blev tilføjet til badet, cellerne faldt en smule, og den ydre fremspring af lamellipodia pause i ca 10 min. Efter cellerne kontrakt, lamellipodia dannelse og omsætning genoptage d. Klik her for at se filmen.

Movie 2. Konfluerende HUVEC udtrykker GFP-aktin, før og efter behandling med thrombin. Forløbet tid er vist i nederste højre hjørne som minutter: sekunder. Intervallet mellem billeder er 30 sek Trombin (1 E / ml) blev tilføjet efter 45 min. baseline periode. Kommenteret hændelser omfatter lokale lamellipodia dannelse og omsætning (pilespidser nær celle kanter, 0:59 - 37:29), aktin skyer (pile, 1:59 til 21:29), og et hul på et tricellular kryds, der udvider efter thrombin er tilføjet (pil, 62:30 - 70:00). Tværgående bue stress fibre er også tydeligt i flere af cellerne. Cellerne viste aktiv dannelse og omsætning af lokale lamellipodia langs deres bander, og mange giver anledning til membran flæser. Trombin forårsagede en pause i lamellipodia dannelse og omsætning, og den korte udseendet af nogle små huller mellem cellerne.http://www.jove.com/files/ftp_upload/3187/Movie2-confluentHUVEC.avi "> Klik her for at se filmen.

Discussion

De billeder af GFP-actin i levende endotelceller muliggør en detaljeret analyse af dynamikken i actin cytoskeleton som reaktion på inflammatoriske stimuli. Denne metode kan også være nyttigt at bygge videre på tidligere resultater viser ombygning af cytoskeleton som reaktion på fysiske kræfter som forskydningsspænding ^11. Desuden giver denne metode en detaljeret vurdering af bidraget fra actin cytoskeletal dynamik til forskellige endotelceller aktiviteter, herunder migration, mitose, dannelse af intercellulære vejkryds og Junctional modning og vedligeholdelse af barrierefunktion.

I de viste data, kan opførslen af ​​endotel actin cytoskeleton iagttages før og efter behandling med thrombin. Lokale lamellipodia langs hele kanten af ​​endotelceller blev observeret formgivning og regressing over tid i både nonconfluent og sammenflydende celle monolag. Behandling med thrombin kortvarigt afbrudt lamellipodia formulartion og omsætning. Trombin forårsagede også cellerne til kontrakten lidt efter aftale med tidligere rapporter om, at thrombin forårsager aktin stress fiber dannelse og øget centripetale spænding udviklingen i endotelceller ^12-14. Men fra levende celler billeddiagnostiske undersøgelser som denne, kan oprindelsen af ​​stress fibre nu bestemmes. I HUVEC, stammer de fleste af stress fibre på cellen periferien og ligner tværgående bue fibre for overgangen celler ^{8, 9.} En anden styrke ved denne metode frem ved hjælp af faste celler er, at antallet af stress fibre kan kvantificeres i individuelle celler før og efter trombin behandling, eliminere selektionsbias mellem eksperimentelle grupper.

Med denne protokol, vi evaluerer dynamisk bevægelse af cellen kant og aktin stress fibre. For at forstå aktin monomere dynamik i endotelceller, mere avancerede teknikker såsom fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) eller fluorescens speckle Microskopi (MFS) kan anvendes ^{15, 16.} Hertil kommer, mikrovaskulære endotelceller da kan udgøre en bedre model af mikrovaskulære barrierefunktion, optimering af transfektion protokoller til effektivt at udtrykke GFP-actin i mikrovaskulære endotelceller repræsenterer en logisk fremtidige retning.

Sammenfattende repræsenterer billedbehandling af levende endothelceller udtrykker GFP-aktin et kraftfuldt værktøj til at bestemme, hvordan endotelceller actin cytoskeleton reagerer på forskellige former for stimuli. Undersøgelser med stramt sammenflydende endotel monolag vil hjælpe med at bestemme de roller, som dynamiske strukturer såsom aktin-rige lamellipodia og tværgående bue stress fibre i endotel barriere funktion. Desuden vil leve cell imaging af endothelceller udtrykker GFP-aktin eller anden fusion proteiner, som tillader visualisering af andre subcellulære strukturer giver detaljerede Spatiotemporal nødvendige oplysninger for at forstå signaler og strukturelle mekanismer, der determine barriere integritet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Ringer 5x Stock
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	JT Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
2. MOPS buffer
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma-Aldrich	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma-Aldrich	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB Corp., Affymetrix	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37°C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C.
4. 0.9% Saline
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-3	9 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
5. 1.5 % Gelatin Solution
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	15 g
0.9% Saline	N/A	N/A	Bring to 1 L
Warm the solution to 37°C to dissolve gelatin sufficiently. While still warm, sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C