Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bilinçli Mesnetlenmemiş Fare hiperinsülinemik öglisemik Kelepçeleri

Published: November 16, 2011 doi: 10.3791/3188
Automatic Translation
1, 2,3, 3, 2,3, 3, 4, 2,3, 2,3
1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

Summary

Hiperinsülinemik öglisemik kelepçe, ya da insülin kelepçe, insülin etkisini değerlendirmek için altın standart

Abstract

Tip 2 diyabet, insülin eylem bir kusur ile karakterizedir. Hiperinsülinemik öglisemik kelepçe, ya da insülin kelepçe, in vivo olarak insülin etkisini değerlendirmek için "altın standart" yöntemi yaygın olarak kabul edilir. Bir insülin klemp sırasında, hiperinsülinemi sürekli insülin infüzyonu ile elde edilir. Euglycemia bir değişken faizli birlikte glukoz infüzyonu ile korunur. Bu değişken glukoz infüzyon hızı (Gir) deney boyunca kısa aralıklarla kan şekeri ölçümü ve buna göre ayarlayarak Gir tarafından belirlenir. Gelişmiş insülin eylem ile fareler daha büyük bir Gir gir, tüm vücut insülin eylem göstergesidir. Insülin kelepçe izotopik 2 idaresi dahil edebilirsiniz [14 C] deoksiglukoz doku-spesifik glukoz alımını değerlendirmek ve [3 - 3 H] glukoz, insülin endojen glikoz görünüm (endoRa) oranı bastırmak için yetenek, bir marker değerlendirmek için hepatik glukoz üretimini teşviktüm vücut glukoz ortadan kalkması (Rd) oranı.

Metabolik hastalık genetik fare modellerinde kullanmak için insülin kelepçe minyatürleştirme diyabet araştırma önemli ilerlemelere yol açmıştır. Insülin kelepçeler gerçekleştirmek için yöntemleri, laboratuarlar arasında değişir. Bir insülin kelepçe yapıldığı şekilde elde edilen sonuçlar önemli ölçüde etkileyebilir dikkat etmek önemlidir. Biz bilinçli fareler 1 yanı sıra, çeşitli kelepçe teknikleri kullanarak 2, yaygın olarak kullanılan dört kendilenmiş fare suşlarının metabolik yanıt bir değerlendirme insülin kelepçeler performans için farklı yaklaşımlar kapsamlı bir değerlendirme yayınlandı. Burada insülin kelepçeler Vanderbilt Mouse Metabolik fenotipleme Merkezi (: www.mc.vanderbilt.edu / mmpc URL MMPC) tarafından geliştirilen, bilinçli, dizginlenmemiş fareler üzerinde gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Bu, insülin klemp sırasında kullanılan kateter implante yöntemi bir açıklamasını içerir. Tarafından istihdam protokolüVanderbilt MMPC benzersiz bir iki kateter sistemi 3 kullanır. Bir infüzyonlar için juguler ven kateteri yerleştirilir. Kan örneklemesi için fare yavaşlatmaya veya işlemek için gerek kalmadan sağlayan karotis arter, ikinci bir kateter yerleştirilir. Bu teknik, kuyruğu kopmuş ucundan örnek insülin kelepçeler sırasında kan örnekleri elde etmek için en yaygın yöntem için önemli bir avantaj sağlar. Bu ikinci yöntemin aksine, bir arteriyel kateter örnekleme fare 1 stresli değildir. Ayrıca, doku-spesifik insülin etkisini değerlendirmek için izotop tracer infüzyonları kullanmak için yöntemler açıklanmaktadır. Biz de uygun insülin kelepçeler elde edilen sonuçların sunumu için kılavuzlar sağlar.

Protocol

1. Örnekleme Erişim için kateterler ve Fare Anten Hazırlama (MASA tm)

  1. Şekil 1A gösterildiği gibi bir silastik tüp 6 cm parça (0.012 inç iç çapı) PE-10 1.3 cm parça (0.011 inç iç çapı) takarak arteriyel kateter hazırlayın. PE-10, bir neşter ucu konik ucu silastik sonundan itibaren uzunluğu 0.9 cm böylece Konik.
  2. Silastik boru 1 mm parça (0.020 inç iç çapı) Şekil 1B gösterildiği gibi silastik tüp (0.012 inç iç çapı) 6 cm parçasının kesik sonundan itibaren 1.1 cm kaydırarak venöz kateter hazırlayın. Silastik 1 mm parça frenleyici boncuğu olarak kullanılır.
  3. MASA tm hazırlamak için, her iki 1.3 cm adet 25 gauge paslanmaz çelik bağlantı PE-20, iki adet 3 cm parçaları (0.015 inç iç çap) her birine takın .
  4. Silastik 5 mm parça kaydırarak birbirine PE-20/connectors Güvenliboru, çelik boru ve PE-20 karşılayacak alana (0.040 inç iç çapı).
  5. ~ 120 ° açılı çelik borular ~ 45 ° bükün ve her tüpün ayrı.
  6. Place tıbbi silikon yapıştırıcı bir topak teçhizat tamamladı, PE 20 boru dikey ve paslanmaz çelik borular uçları yapışkan (Şekil 1C) ötesine . Bu 24 saat için ayarlamak için izin ver.

2. Cerrahi kateterizasyon

  1. Ameliyat öncesinde,% 70 etanol ile kateterler sterilize heparinize salin ile onları doldurmak (200 U heparin / ml serum fizyolojik) ve paslanmaz çelik bujileri takın.
  2. Tercihen sürekli (örneğin inhale izofluran) anestezik madde teslim bir yöntem kullanarak, fare anestezisi.
  3. Steril tekniği kullanarak, kesme makineleri ve / veya tüy dökücü krem ​​kullanarak kesi sitelerinden saç kaldırmak ve bir betadin fırçalayın alkol ile cilt dezenfekte edin. Kateter yerleştirilmesi için, saç kaldırmakbölge göğüs kafesinin üst ve alt çene clavicles arasında uzanır. Başın arkasında kateter dışa için, kafatasının taban ve interskapular bölge arasındaki bölgede saç kaldırmak ve bir betadin fırçalayın ardından alkol ile cilt dezenfekte edin.
  4. Bir ısınma yüzeyine sırtını ve fareyi bir cerrahi mikroskop görüş alanı altında yatıyordu. Kuyruk ve ekstremitelerde cerrahi bant ile sabitleyin. Anestezi teslim burun konisi kafa sabitleyin.
  5. Sternum için sefalik küçük bir dikey orta hat kesi 5 mm olun. Forseps kullanarak, sol sternomastoid kas maruz doku disseke künt. Sol karotis arter ortaya çıkarmak için bu kas yansıtmaktadır. Arter yavaşça bağ dokusu alay. Vagus sinir, arter veya sinir ya zarar vermeden arter izole etmek için, bu noktada önemlidir.
  6. Arter izole etmek ve ipek sütür ile sefalik ucu Arter. Gevşek düğüm başka birmaruz kalan geminin kaudal ucunda sütür parçası.
  7. Kelepçe ve kuyruk ucunda bir mikro-serrefine kelepçe ile gemi yaylı makas ile bağlanan ucunun altına kesmek. Dikkatli bir şekilde okuyun kadar kelepçeli olarak kateter yerleştirin. Mikro-serrefine kelepçe dikkatlice bırakın ve silastik-PE kavşak kateter ilerlemek.
  8. Kateter güvenli bir şekilde iki bitişik harfler Kravat ve onaylamak bir örnekleme şırınga kateter serbest ucuna bağlayarak kateter örnekleri.
  9. Başka bir kesi 5 mm, orta hat sağ ve ilk kesi kaudal yaklaşık 2 mm. Forseps kullanarak, sağ juguler ven ortaya çıkarmak ve izole etmek için doku disseke künt.
  10. Ipek sütür ile sefalik ucu dikkatlice bağlanır ve gevşek kaudal sonunda başka bir parça dikiş kravat.
  11. Sadece yay makas ile sefalik ligatür altında kesin ve frenleyici boncuk kateter yerleştirin. Boncuk arkasında bir dikiş Kravat ve kateter örnekleri doğrulamak.
  12. Turn fare ve kürek kemikleri arasında küçük bir kesi yapmak.
  13. Farenin ön arka interskapular kesi kesi arteriyel kateter cilt altında Tünel 14-gauge iğne,. Fare geri exteriorize iğne ile arteriyel kateter konu. Interskapular arkasındaki kesi ön kesi sitesinden farenin sağ tarafında 14-gauge iğne derinin altında tünel juguler ven kateteri için bu işlemi tekrarlayın.
  14. Kelepçe kürek kemikleri arasında kesi yerinde bir mikro-serrefine kelepçe ile arteriyel kateter. Bu kelepçe ~ 1 cm yukarıdaki kateter kesin. Fare kafası doğru bakacak şekilde paslanmaz çelik bağlantı ile MASA tm yerleştirin. Arteriyel kateter farenin sol tarafına doğru işaret paslanmaz çelik konnektörüne bağlayın. Kateter hiçbir delik ya da bükülmesinden yaşanmaması için özen gösterin. Venöz kateter için yineleyin.farenin sağ tarafına işaret paslanmaz çelik bağlantı bağlayarak.
  15. MASA tm kürek kemikleri arasında insizyon içine yerleştirin. Juguler ven kateteri ile ilgili PE-20 tüp sol olmalıdır farenin sağ tarafında ve arteriyel kateter ilgili PE-20 boru olmalıdır.
  16. Naylon sütür ile ventral ve dorsal kesiler kapatın. Dorsal kapatılması için, dikiş yerine sabitlemek için MASA tm sertleştirilmiş silikon ile çalıştırmak olabilir. Heparinize salin ve bir antibiyotik içeren bir kızarma çözüm kullanarak kateter enfeksiyon riskini en aza indirmek için açıklığı onaylayın. Acil kurtarma için ısıtılmış temiz bir kafes yerleştirin fare Şekil 2 bitmiş ürün gösterir .
  17. En az 5 gün boyunca kurtarmak için fare izin verin. Ağırlığı ve genel sağlık izleyin. Uygun post-operatif analjezik rejimi, kurum Hayvan Bakım tarafından onaylanmış gibi yararlanmak veKomite kullanın.

3. Hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe

  1. 5-6h Hızlı fare. Referans olarak, zaman t = 0 dakika hızlı ve insülin ve glukoz infüzyonu (yani kelepçe dönemi) başından sonuna ifade eder.
  2. Tipik bir deney için kurulum ve zaman çizgisi Şekil 3'te gösterilmiştir. Infüzyon ve örnekleme hatları için Micro-Renathane veya eşdeğer boru kullanın. Fare üzerinde bir dual-channel döner Askıya Alma. Bu fare ve infüzyon / örnekleme şırınga arasında bir merkez olarak hizmet vermektedir. Deney sırasında, fare bir ev kafes veya benzeri bir kap içinde kalır ve döner gergin.
  3. Fare bağlamadan önce, heparinize salin ile arteryel örnekleme hattı dolduracak (10 U heparin / ml serum fizyolojik) ve paslanmaz çelik bağlantı hattının alt ucunda bir yerde. Örnekleme hattı üst bağlı heparinize salin (takas şırınga) ile bir şırınga bırakın. Bu kan samp çekmek için kullanılır.les.
  4. Döner infüzyon port (Segment Şekil 3A A) çizginin altındaki tüm yol itibaren heparinize olmayan tuzlu su ile venöz infüzyon doldurun. Çizginin üst ucunu ve alt satırın sonunda (bolus uygulanabilir olup olmadığını ya da Y-konnektör) paslanmaz çelik bağlantı yerleştirin. Izotopik glikoz tracer (örneğin [3 - 3 H] glukoz) Eğer aşılanmış olmanın, tracer bir infüzyon şırınga içeren 1 ml şırınga güvenli. Venöz infüzyon, tuzlu su tracer yerine (Şekil 3B) ile doldurun .
  5. Üç saat içine hızlı, fare tartmak ve sırasıyla juguler ven ve arteriyel kateter infüzyon ve örnekleme hatları bağlamak için PE-20.
  6. [3 - 3 H] yönetmek, glikoz tracer t astarlanmalıdır sürekli tracer infüzyon başlamak = -90 dakika (Şekil 3C). Tipik bir priming doz 1 μCi. Glukoz eriyik 0.05 μCi / ml [3 H 3] hazırlayınnon-heparinize salin n. 1 ml şırınganın içine çözüm yükleyin ve bir infüzyon pompası şırınga güvenli. 20 ul / 1 dk dk beslerken priming doz yönetin. 0.05 μCi / dk (1 ul / dk) 90 dakika dengeleme dönemi için sürekli infüzyon ile devam edin.
  7. Insülin ve glikoz infusates hazırlayın. İnsülin heparinize olmayan serum fizyolojik içinde% 3 plazma içeren bir taşıyıcı (BSA uygun bir konsantrasyon da kullanılabilir) olarak hazırlanmıştır. Glikoz infusates konsantrasyonları (% 5, 20 ve 50) çeşitli ticari olarak kullanılabilir.
  8. Tercihen deneysel fare gibi aynı suş arka plan, bir donör fare tam kan almak suretiyle, tuzlu su yıkanmış erythorocyte infusate hazırlayın. Tipik olarak 1 ml tam kan çalışmada fare başına ihtiyaç vardır. Santrifüj ayrı eritrositler kan. Eritrositler 10 U / ml heparinize salin ile yıkayın ve tuzlu su atmak için santrifüj. Eritrosit hacminin belirlenmesi ve 10 U / ml hepari eşit hacmi tekrar süspansiyontuzlu nized.
  9. 1 ml şırınganın içine her infusate çizin ve ayrı bir infüzyon pompası her şırınga güvenli. 4-yolu bağlantısı (Şekil 3) her bir şırınga bağlayın.
  10. T = -15 min 50-100 ul kan temizleme şırıngaya yavaş yavaş çizerek bir kan örneği almak. Kelepçe arteryel örnekleme hattı ve takas şırınga kaldırmak. Elle tutulan şekeri ölçüm cihazı kullanarak, arteryel örnekleme hattına kelepçe kaldırılması ve kan şekeri metre şerit akmasına izin veren bir kan şekeri okuma alır.
  11. Şekeri ölçüm alındıktan sonra, arteryel örnekleme hattı kelepçe ve künt bir iğne şırınga (örnekleme şırınga) arteryel örnekleme hattı içine yerleştirin. Kelepçe çıkarın ve örnekleme şırıngaya kan hacmi (Not) çizin. Kelepçe arteryel örnekleme hattı ve örnekleme şırınga çıkarın. Arteryel örnekleme hattı temizleme şırınga geri takın. Herhangi bir hava kabarcığı kaldırmak ve yeniden demlenmeye piston DrawBaşlangıçta çizilen kan 50-100 ul.

Not: örneklenmiş kan hacmi gerçekleştirilen analiz bağlıdır. Örneğin, [3 - 3 H] analiz plazma glukoz konsantrasyonu 10 ul gerektirir, bu nedenle 50 ul kan çekilir . Bu, gerektiğinde analiz ek plazma için yeterli plazma, 20-30 ul verir . Hormonlar ve diğer metabolitleri (örneğin insülin, serbest yağ asitleri) ölçümleri, örnekleme ek kan gerektirir .

  1. Kan örnekleme şırınga EDTA kaplı mikrotüp içine koyun. Santrifüj ve plazma toplamak. Plazma -20 ° C'de çalışma ya da hemen mağaza sonuna kadar buz tutun.
  2. , T = -5 dakika 3.12 üzerinden 3.10 adımları tekrarlayın. Bazal plazma insülin seviyelerinin ölçümü için ek kan (50 ul) edinin. Heparin veya EDTA ile tedavi edilen bir kapiller tüpe kan çizerek bazal hematokrit ölçün. Bu ölçümler elde from plazma numuneleri, t = -15 ve -5 dakika başlangıca (yani açlık) değerleri temsil eder.
  3. Örnek t = -5 dk sonra, 4-yönlü bağlantı, glukoz, insülin ve tuzlu yıkanmış eritrosit infüzyon çizgileri doldurmak. Şekil 3'te görüldüğü gibi döner infüzyon portu (glikoz veya [3 H 3] beslerken, tüp Y-konnektör bağlı) bağlı borular için 4-way konektörünü.
  4. Ilk olarak tuzlu-yıkanmış eritrosit beslerken başlayın. (Toplam 500 ul kan çalışmada 120 dakika boyunca numune eğer, örneğin 4.2 ul / dk infüzyon hızı), çalışma süresi boyunca örnek alınan toplam kan hacminin yerine infüzyon hızı ayarlayın. Diğer infusates aksine, eritrosit çözüm kırmızıdır. Bu çözüm beslerken ilk olarak belirlenmeli ve düzeltilmelidir infüzyon hatları, herhangi bir potansiyel direnç ya da engel sağlar.
  5. Eritrosit infusate fare ulaştığında, insülin başlayacak veglukoz infüzyonlar. Bu t = 0 dak. İnsülin bir sabit, önceden belirlenmiş bir oranda demlenir. • kg -1 dk -1 4 mU bir insülin infüzyon hızı genellikle endojen glukoz üretiminin% 80-100 bastırmak ve glikoz ortadan kalkması 2-3 kat teşvik edecektir. Ilk glukoz infüzyon hızı (Gir) bazal kan şekeri düzeyleri ve önceki tecrübelerine dayalı tahmin edilmektedir.
  6. [3 - 3 H] beslerken Eğer glukoz, bir glikoz ciro tahmini artış (genellikle 2-3 kat artış) maç izleme infüzyon hızını artırmak için tercih edebilir.
  7. Fare glukoz cirosu yüksek oranı göz önüne alındığında, arteriyel hattan daha az glikoz konsantrasyonunun ölçülmesi için deney süresi boyunca her 10 dakikada bir kan örnekleri alınmalıdır. Hedef euglycemia (Şekil 3C) elde etmek ve korumak için Gir ayarlayın. Bu hedef, model veya çalışmanın amaçlarına bağlı olarak değişebilir. Iyi bir hedef glucose konsantrasyonu 150 mg dL-1 chow beslenen C57Bl/6J fare için tipik bir 6h oruç tuttuklarını glukoz düzeyi.
  8. Amaç, ilk 40-50 dakika içinde ideal, hızlı euglycemia ulaşmak için, glikoz ve Gir istikrarlı ve kararlı durum bir süre (t = 80 dk) başında var.
  9. [3 - 3 H] beslerken Eğer glukoz, t = 80, 90, 100, 110 ve 120 dakika plazma ölçümü için ek kan almak [3 - 3 H] glukoz spesifik aktivite.
  10. T = 100 ek kan ve plazma insülin ölçümü ve herhangi bir diğer hormon (ler) veya metabolitinin (ler) için 120 dakika toplayın. T = 110 dakika, kelepçe hematokrit ölçümü için heparin veya EDTA tedavi kapiller tüpe kan çizin.
  11. Örnek sonra t = 120 dakika alınır, 2 [14 C] deoksiglukoz doku-spesifik glukoz alımını ölçümü için verilebilir. (Şekil 3B juguler örnekleme hattına bağlı bolus hattına 12 μCi puşe
  12. T = 2, 15, 25 ve plazma 2 [14 C] deoksiglukoz seviyeleri ölçümü için bolus uygulamadan sonra 35 dakika arteriyel örnekleme hattı alınan kan örnekleri (50 ul) edinin.
  13. Son örnek sonra, arter hattına doğrudan verilen pentobarbital bir infüzyon ile fare uyutmak. Glukoz alımı değerlendirmesi (örneğin çeşitli türleri, yağ dokusu, kalp, beyin, iskelet kasları) ve diğer dokularda (örneğin, karaciğer, dalak, böbrekler) için gerekli tüm dokular hızla teşrih. -80 Sıvı azot ve mağaza dokularda donma çekin analiz ° C 'ye kadar. Doku şekeri ölçüm fosforile 2 birikimi analiz edilir [14 C] dondurulmuş dokularda deoksiglukoz ve plazmadan 2 [14 C] deoksiglukoz ortadan kalkması.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Bir insülin kelepçe deneyde elde edilen sonuçların bir örneği Şekil 4'te gösterilmiştir.Bu örnek, farelerde çökelti insülin direnci ve yüksek yağlı diyet yeteneğini gösterir. Kan glikoz seviyelerinin bir süre ders, bir süre ders Gir ve plazma insülin düzeyleri (başlangıç ​​ve kelepçe): insülin kelepçe sonuçlarının Tüm sunumlar yorumlanabilir için aşağıdaki içermelidir. Burada gösterildiği gibi, açlık kan şekeri (Şekil 4A) ve insülin (Şekil 4C) düzeyleri insülin direnci gösteren bir yüksek yağlı diyet beslenen farelerde yüksektir. Kelepçe çalışma boyunca glikoz düzeyleri (Şekil 4A) bir süre ders sunmak okuyucu kelepçe kalite göstergesi olan, euglycemia bakımı ne kadar iyi değerlendirmek için izin verir. Benzer şekilde, bir zaman ders Gir (Şekil 4B) okuyucu, sabit-devlet ne kadar hızlı elde belirlemenize olanak verir . Zamanlı kurslar, 2 saatlik bir deneme sunma fare insülin kelepçe literatürde geleneksel uygulamaya göre anlamlı derecede daha bilgilendirici olduğu gibi bu veriler gösterilentanımsız bir "kıskaç" dönemi (4-13) ortalama değerleri temsil eden tek bir referans noktası olarak. Bu örnekte, glukoz düzeyleri kontrol ve yüksek yağ ile beslenen gruplar arasında eşit, ama Gir yüksek yağ ile beslenen grup (Şekil 4B) anlamlı olarak daha düşüktü. Bu bütün vücudun insülin eylem bir bozukluğun göstergesidir. Kelepçe insülin düzeyleri daha bu farelerde insülin dirençli fenotip varlığını destekleyen, yüksek yağ ile beslenen grup (Şekil 4C) da daha yüksek bulunmuştur. Izotop tracer enfüzyon kullanımı belirli dokularda insülin eylem değerlendirmesi için olanak sağlar. [3 - 3 H] glukoz hepatik glukoz üretimini (HGP) ve tüm vücut glukoz ortadan kalkması (Rd) oranı bir dizin endojen glukoz görünüm (endoRa) oranını tahmin etmek için kullanılmıştır. Insülin tamamen kontrol farelerde İnsan Genomu Projesi bastırır Oysa, bu yüksek yağ içeren bir diyet (Şekil 4D) beslenen farelerde bozulur. Benzer şekilde, bir yeteneğiyüksek yağlı diyet (Şekil 4E) beslenen farelerde kontrol farelerde Rd uyarmak için sulin tehlikeye düşer. 2 [14 C] deoksiglukoz glikoz metabolik indeksi (Rg), doku-spesifik glukoz alımını bir ölçüsüdür değerlendirmek için kullanılır. Bu örnekte görüldüğü gibi, iskelet kas içine insülin ile uyarılmış glukoz alımı, yüksek yağlı diyet (Şekil 4F) beslenen farelerde bozulur .

Şekil 1
Şekil 1: arteriyel (A) ve (B) venöz kateterler ve (C) MASA tm hazırlanması. Arteriyel kateter 0,012 "ID silastik 6 cm parçası haline yaklaşık 3 mm PE-10 1.3 cm bir parça ekleyerek hazırlanır. PE-10 ucu silastik eğim uzunluğu 0.9 cm olduğu gibi eğimli. Venöz kateterler ID silastik 0.020 0.012 6 cm parçasının kesik sonundan itibaren kimliği silastik 1.1 cm "küçük bir parça sürgülü tarafından yapılır. se frenleyici bir boncuk olarak 0.020" ID silastik parça eylemleri juguler ven kateteri tedavi. MASA tm, her iki 1.3 cm montajı için 25-gauge konnektörleri PE-20, iki adet 3 cm adet her biri eklenir. Bunlar 0.040 "ID silastik küçük bir parça ile birlikte yapılmaktadır. Konektörleri 120 ° açı 45 ° 'lik açıyla bükülmüş ve ayrılır tüm kurul tıbbi silikon yapıştırıcı batırılır.

Şekil 2
Şekil 2: kateterize fare. Kateterler, sol karotis arter ve sağ juguler ven cerrahi olarak implante edilirler. Kateter ücretsiz biter başın arkasında dışsallaştırdığı MASA tm bağlı. MASA tm omuz kemikleri arasında subkütan eklenir. Bu fare, dizginlemek, işlemek veya uyutmak için gerek kalmadan insülin kelepçe deneyler sırasında vasküler erişim sağlar.

jpg "/>
Şekil 3: Bir insülin kelepçe deney için kurulum ve zaman çizgisi olarak gösterilmesi. Fare, infüzyon ve örnekleme şırıngalar için bir hub olarak hareket eden bir dual-channel dönebilen bağlı. Deneyler için tipik kurulumları tracer infüzyonları (A) ve her ikisini de kullanarak [3 - 3 H] glikoz ve 2 [14 C] deoksiglukoz (B) gösterilmektedir. Bir zaman çizgisi kurma ve insülin kelepçe (C) yapmak için prosedürler de gösterilir. Sırasında kelepçe, kan örnekleri ( kan ) Her 10 dakikada bir kan şekeri ölçmek için alınır. Gir euglycemia korumak için buna göre ayarlanır. Örnekleri glukoz başlangıç ​​kan glukozu, plazma insülin ve plazma [3 - 3 H] için t = -15 ve -5 dakika alınır. Kelepçe plazma [3 - 3 H] Örnekler glikoz, t = 80, 90, 100, 110 ve 120 ve t = 100 ve 120 dakika kelepçe insülin alınır . 2 [14 C] deoksiglukoz t = 120 dk ve b örnek sonra uygulanırlood t = 2, 15, 25 ve sonra 35 dakika toplanır. T = 35 dakika örnek sonra dokular alınır.

Şekil 4
Şekil 4: farelere yüksek yağ içeren diyet (YYD) bir kontrol diyeti fareler (Chow) karşılaştıran bir insülin kelepçe deney sonuçları. Arteriyel glukoz (A) ve Gir (B), temel ve kelepçe insülin (C), EndoRa (D), ve Rd (E) ve iskelet kası (gastroknemius ve vastus lateralis) Rg (F) Zaman kursu gösterilmiştir. Tüm sonuçlar, yüksek yağ içerikli beslenme, insülin direncine neden bir etkisinin olmadığını göstermektedir.

Discussion

Hiperinsülinemik öglisemik kelepçe, ya da insülin kelepçe, in vivo olarak insülin etkisini değerlendirmek için "altın standart" yöntemi yaygın olarak kabul edilir. Bu teknik, insan, köpek, sıçan ve fareler de dahil olmak üzere çeşitli türlere uygulanan olmuştur. Metabolik bozukluklar için transgenik fare modelleri, sayıları giderek artan göz önüne alındığında, fare kullanmak için tekniğin minyatürleştirme, metabolik araştırma için önemli ilerlemeler sağladı.

Insülin kelepçe arkasındaki kavramlar basit olmasına karşın, uygulamada insülin kelepçe deneyler için farklı yaklaşımlar vardır. Deney yapıldığı şekilde 1 Elde edilen sonuçlar, etkiler, çünkü bu önemsiz bir nokta değildir. Burada Vanderbilt MMPC tarafından kullanılan protokol mevcut. Başkalarının bizim protokol ve arasındaki temel ayrım, biz kan örnekleri elde etmek için bir arteriyel kateter kullanılmış olmasıdır. Bu obt, daha yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım aksinekuyruk 4, 7, 11, 12, 14-17 ucu kesilmesinin kan örnekleri aining. Arteriyel kateter numune alma avantajı, bilinçli ve pervasız bir fare deneyi yapılır. Örnekleme kuyruk genellikle kısıtlama gerektirir ve büyük kan örnekleri 1 makinasını satın aldığı zaman stres endeksleri artar. Stres hormonları endojen glukoz üretimini teşvik etmek ve glikoz bertaraf 18, 19 olumsuz, potansiyel bir insülin dirençli fenotip görünüm vererek. Kesilmiş kuyruk Örnekleme stresli doğası nedeniyle özel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı gerekebilir. Arteriyel kateterizasyon prosedürü, fare kuyruğu kesilmesinin stresi önlemek için geliştirilmiştir.

Insülin kelepçeler yerine bir önemli yönü euglycemia korumak için yeteneğidir. Doğru gir, kan şekeri okumalara göre ayarlanır nasıl olması gerektiği tahmin algoritmaları vardır. Ameliyat gibi,insülin kelepçe deneylerini personelin deneyimi ile sadece makul euglycemia korumak yeterli olacak. Çünkü onların yüksek metabolizma hızı Fareler üzerinde yapılan çalışmalarda elde edilen veriler, doğal gürültülü olacağına dikkat etmek önemlidir. Bu, glikoz ve Gir kursları ve plazma insülin, endoRa, Rd ve sonuçlarını yorumlamak için herhangi bir okuyucu yeteneği önemli Rg mutlak değerler de dahil olmak üzere veri tam bir sunum yapar. Fare (insanlarda oranı yaklaşık 5 kat daha yüksek) yüksek glukoz akı glikoz örnekleme yüksek frekanslı garanti. Farenin kan hacmi sınırlı olmakla birlikte, en az bir kez her 10 dakikada bir örnekleme frekansı, yeterli bir kelepçe elde edildiğine emin olmak için gereklidir.

Şekil 4'te görüldüğü gibi, kelepçe insülin düzeyleri gruplar arasında farklı olabilir. Bu tür diyet müdahaleler, transgenik manipülasyonlar veya arka plan suşları farklılıkları gibi faktörler sülfüroz etkileyebilir.daha sonra kelepçe insülin düzeylerini etkileyen ting insülin seviyeleri. Kelepçe insülin seviyeleri farklı olduğunda sonuçlarını yorumlama sorunlu olabilir. Bu deneysel gruplar arasında eşdeğer kelepçe insülin düzeylerine ulaşmak insülin infüzyonu oranlarını belirlemek için pilot deneyler tarafından ele alınabilir. Alternatif olarak, somatostatin, pankreatik hormon salgılanması inhibe etmek için kullanılır, ve insülin ve glukagon deneysel kontrol fiyatla değiştirilebilir. Bu ikinci yaklaşım, farelere göre fareler üzerinde daha yaygın, insülin kelepçeler yapılır. Bu deneysel yaklaşımlar alınmadığı takdirde, kararlı devlet Gir kelepçe insülin düzeyi normalize edilebilir, ya da bir insülin duyarlılığı indeksi (S) S I = Gir / (G • ΔI), kelepçe veri elde edilebilir G kararlı durum glukoz konsantrasyonu ve ΔI, açlık ve kelepçe insülin konsantrasyonları arasındaki fark. Bir varsayım ya da yaklaşımı ile elde edilen kelepçe insülin düzeyi olduğunuinsülin duyarlılığı doğrusal çalışılan gruba göre insülin düzeyi ilgili aralığında. İnsülin direnci ve insülin hassas gruplar karşılaştırırken Bu ikinci varsayım geçerli olmayabilir. İdeal olarak, bir insülin doz yanıt eğrisi uygun insülin infüzyonu seçmek için oluşturulmalıdır. Ancak, ilave deneyler için gereğinin, bu nadiren yapılır.

Arteriyel kateterizasyon tarafından sağlanan çok yönlülük, deneysel yaklaşımlara öglisemik kelepçeler ötesine uzanır. Örneğin, glukoz, açlık kan şekeri göre hiperglisemi korumak için bir değişken hızda infüze olduğu hiperglisemik kelepçeler, in vivo 2, 20, 21, endojen pankreatik fonksiyonu değerlendirmek için kullanılabilir . Bu test sırasında, ilk faz insülin salgılanması ölçümü, kan örnekleri sık sık satın alma (yani her 2-5 dakikada bir), kuyruk ucu örnekleri elde etmek mümkün değildir gerektirir. Ayrıca,kuyruk örnekleme kaynaklanan artmış katekolaminler insülin salgılanması zarar ve glukagon sekresyonunu 22 artırabilirsiniz. Insülin kelepçe protokolü de glukoz düzeyleri karşı-düzenleyici yanıt 2, 23, 24 değerlendirmek için göreceli hipoglisemi düşmek için izin verecek şekilde modifiye edilebilir. Arteriyel kateterizasyon da 25-30 egzersiz sırasında glikoz metabolizmasının dinamikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu, tek bir zaman noktasında yapılan geleneksel yaklaşımları içinde önemli oranda avantajlı öncesi ve sonrası egzersiz veya izole kasları ex vivo . Burada sunulan teknikleri de sadece glikoz değil, aynı zamanda yağ asidi metabolizması 31 değerlendirmek için kullanılabilir.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma Vanderbilt Mouse Metabolik fenotipleme Merkezi Hibe 5-U24-DK059637-10 tarafından desteklenmiştir.

References

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. , (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

Tags

Tıp Sayı 57 Glikoz insülin kelepçe fareler kısıtlama-insülin direnci diyabet karaciğer kas bilinçli olmayan stresli
Bilinçli Mesnetlenmemiş Fare hiperinsülinemik öglisemik Kelepçeleri
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Ayala, J. E., Bracy, D. P.,… More

Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter