כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה בין א coli ואחריו אניון מטבע כרומטוגרפיה, His6, תג עם הסרת פרוטאז TeV, וגודל-הדרה כרומטוגרפיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Hsp104 הוא hexameric AAA + חלבון 1 של שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ATP לחלבון disaggregation 20-10 (איור 1). פעילות זו מקנה שני יתרונות מרכזיים סלקטיבית. ראשית, renaturation של אגרגטים מופרעת על ידי Hsp104 מסמיך הישרדות שמרים לאחר חלבונים misfolding מדגיש שונים, כולל הלם חום 3,5,11,12. שנית, שיפוץ צולבות סיבי עמילואיד ביתא על ידי Hsp104 מאפשרת שמרים לנצל פריונים עצום (amyloids זיהומיות) כמאגר של מועיל תורשתי וריאציה פנוטיפי 13-22. למרבה הפלא, Hsp104 ישירות remodels oligomers preamyloid ו סיבי עמילואיד, כולל אלה מורכבת של חלבונים הפריון שמרים Sup35 ו Ure2 23-30. פונקציונליות זו עמילואיד שיפוץ הוא פן מיוחד של שמרים Hsp104. E. orthologue coli, ClpB, נכשל preamyloid oligomers לשפץ או סיבי עמילואיד 26,31,32.
Orthologues Hsp104 נמצאים בכל ממלכות החיים חוץ, להביך, בעלי חיים. ואכן, אם תאים חיים בעלי כל המערכת האנזימטית שזוגות disaggregation חלבון renaturation (ולא השפלה) נשאר 33-35 ידוע. לפיכך, אנו ואחרים הציעו Hsp104 עשוי להיות מפותח כסוכן הטיפולי למחלות ניווניות שונות הקשורות misfolding של חלבונים ספציפיים לתוך oligomers preamyloid רעילים סיבי עמילואיד 4,7,23,36-38. אין טיפולים ישירות ליעד מינים מצטברים הקשורים למחלות אלה. עם זאת, Hsp104 מתמוסס oligomers רעילים סיבי עמילואיד מורכב אלפא synuclein, אשר מחוברים עם מחלת פרקינסון 23, כמו גם צורות של PRP עמילואיד 39. חשוב לציין, Hsp104 מפחית הצטברות חלבון מקילה ניוון מוחיים מכרסמים במודלים של מחלת פרקינסון 23 ו - 38 מחלת הנטינגטון. באופן אידיאלי, כדי לייעל את הטיפול ולמזער את תופעות הלוואי, Hsp104 יהיה מהונדסים potentiated סלקטיבי לשפץ אגרגטים ספציפי מרכזי המחלה שאלה 4,7. עם זאת, הבנה מבניים מכניסטית מוגבל של כמה Hsp104 disaggregates כזה רפרטואר מגוון של מבנים מצטברים חלבונים שאינם קשורים מתסכל אלה במאמצים 30,40-42.
כדי להבין את המבנה ואת מנגנון של Hsp104, חיוני ללמוד את חלבון טהור מחדש פעילות disaggregase שלה עם רכיבים מינימליים. Hsp104 הוא חלבון 102kDa עם לצרכן של 5.3 ~, אשר hexamerizes בנוכחות ADP או ה-ATP, או בריכוזים בחלבונים בהעדר 43-46 נוקלאוטידים. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור טיהור של פעיל ביותר, Hsp104 יציב מ E. coli. השימוש E. coli מאפשר פשוטה בקנה מידה גדול ייצור השיטה שלנו יכולה להתבצע במהירות ובאופן אמין עבור Hsp104 וריאנטים רבים. פרוטוקול שלנו מגדילה Hsp104 טוהר מפשט הסרת 6-התג שלו לעומת שיטת טיהור הקודם מתוך ה coli 47. יתר על כן, פרוטוקול שלנו הוא קליל ונוח יותר מאשר שני הפרוטוקולים מאוחרים יותר 26,48.
פרוטוקול
1. הביטוי של Hsp104
- הפלסמיד המועסקים לטיהור ב E. coli, pPROEX-HTb-Hsp104, מכיל את Hsp104 לפתוח קריאת מסגרת בשליטת ועין מתנהלת של האמרגן TRC 26. הפלסמיד מייצר Hsp104 עם תג 6-N-מסוף שלו כי ניתן להסיר על ידי מחשוף פרוטאז TeV. המרה pPROEX-HTb-Hsp104 לתוך קודון ממוטב E. coli BL21-CodonPlus-RIL תאים (Stratagene, Agilent Technologies) באמצעות הליך טיפוסי השינוי חיידקי (למשל על פי הוראות היצרן). חשוב להשתמש קודון ממוטב E. coli זן Hsp104 כי יש הטיה קודון יוצא דופן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ציר הזמן: עבור פעילות Hsp104 מקסימלי אנו ממליצים על ערכת טיהור כולו יושלם במהירות האפשרית. עם זאת, את מספר הצעדים טיהור הופך לוח זמנים תובעני כי לא תמיד מעשית. אם הפעולות לטיהור מתבצעות מהר ככל האפשר, את הזמן מסוף ביטוי לילה ועד 2-4 שעות של דגירה על 30 מעלות צלזיוס עם TeV פרוטאז הוא כ 9-11 שעות. מקום אחד פוטנציאלי כדי להשהות את הצעד הבא הוא מחשוף TeV. אם הכרחי, Hsp104 ניתן לצלם קפוא לאחר שלב זה, כמתואר לעיל (שלב 5.2). גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שלב 3.9) מבוצע ומיד לאחר ההפשרה ו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ-NIH (5T32GM008275-22) ואת הלב האגודה האמריקאית מענק predoctoral (עד EAS), כימיה, ביולוגיה ממשק אחוות מ-NIH (2T32GM071339-06A1) (על MED); ומענקים מן NIH (1DP2OD002177-01 ו-NS067354 0110), אליסון רפואי הקרן, ואת ביל ומלינדה גייטס (ל JS).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | |
| BL21-CodonPlus-RIL תאים המוסמכת | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 | |
| 2XYT מרק | USB | 75864 | |
| השלם, מיני, EDTA ללא מעכבי פרוטאז טבליות | רוש | 1836170 | |
| Pepstatin | סיגמא | P4265 | |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 | |
| Amicon Ultra-15 יחידות מסנן צנטריפוגלי (MWCO 30000) | Millipore | UFC903008 | |
| משאבים ש - טור 6ml | GE Healthcare | 17-1179-01 | |
| proTEV פרוטאז | Promega | V6052 | |
| AcTEV פרוטאז | Invitrogen | 12575015 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Hsp40 | Assay עיצובים | SPP-400 | |
| Hsp72 | Assay עיצובים | ADI-NSP-555 |
מקורות
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System th....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
