Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול חזק לבידוד ולתרבות של תאי גזע רכס עצביים מן זקיקי שיער אדם.
Abstract
זקיקי שיער עוברים צמיחה לכל חיים ומחזור השיער הוא תהליך מבוקר היטב מעורב שגשוג ורגיעה לתאי גזע. בליטת שיער היא נישה מאופיינת היטב לתאי גזע בוגרי 1. זה קטע של נדן השורש החיצוני מכיל מספר סוגים שונים של תאי גזע, כוללים תאי אפיתל גזע 2, בתאי גזע מלנוציט 3 ו רכס עצבי כמו תאי גזע 4-7. זקיקי שיער מייצגים מקור נגיש ועשיר לסוגים שונים של תאי גזע אנושיים. אנחנו ואחרים מבודדים תאי גזע עצביים לפסגה (NCSCs) מזקיקים עובריים ובוגרים שיער אדם 4,5. תאי גזע אנושיים אלו הנם תווית ייצוב תאים ומסוגלים התחדשות עצמית באמצעות חלוקת תאים סימטריות במבחנה. הם מבטאים סמנים בשלים עצביים רכס סלולריים אך לא סמני בידול. מחקר פרופיל הביטוי שלנו הראה שהם חולקים דפוסי ביטוי גנטי דומים עם העור העכברי העצבי cre לא בוגרתאי רחוב. הם מפגינים multipotency המשובט שיכול להצמיח שושלות תאים myogenic, melanocytic, ולאחר עצביות בתרבות תא הבודדה המשובטת מבחנה. תאים מובחנים לא ירכשו רק סמני שושלת ספציפיים אלא גם להדגים פונקציות מתאימות בתנאי vivo לשעבר. בנוסף, NCSCs אלו מראים פוטנציאל התמיינות לכיוון שושלות mesenchymal. תאים עצביים מובחנים יכולים להתמיד במוח עכבר ולשמר סמני בידול עצביים. הוכח כי שיער הזקיק נגזר NCSCs יכול לעזור לצמיחה מחודשת עצב, והם משפרים את התפקוד מוטורי בעכברים מושתלים עם תאי הגזע האלה לאחר פגיעה בחוט שדרת transecting 8. יתר על כן, עצבים היקפיים תוקנו עם שתלים של תאי גזע 9, והשתלה של תאים מבשרים עור הנגזרים סמוכים לעצבי sciatic מרוסקים הביא לחידוש יצירת המיאלין 10. לכן, NCSCs הזקיק / עור השיער נגזר כבר הראה תוצאות מבטיחות עבור rטיפול egenerative במודלים פרה.
תא סומטי תכנות מחדש לתאי גזע pluripotent מושרים (IPS) הראה פוטנציאל עצום לרפואת רגנרטיבית. עם זאת, עדיין קיימות בעיות רבות עם תאי iPS, ובמיוחד על ההשפעה ארוכת הטווח של אינטגרצית אונקוגן / וירוס וtumorigenicity פוטנציאל של תאי גזע pluripotent לא טופל כראוי. יש עדיין מכשולים רבים כדי להתגבר עליהם לפני שניתן יהיו להשתמש בתאי iPS לרפואת רגנרטיבית. ואילו תאי גזע הבוגרים ידועים כדי להיות בטוח והם כבר בשימוש קליני במשך שנים רבות, כגון השתלת מח עצם. חולים רבים כבר נהנו מהטיפול. תאי גזע בוגרי autologous עדיין תאים מועדפים להשתלה. לכן, תאי גזע הבוגרים הנגישים וניתן להרחבה בזקיקי עור אדם / שיער הם מקור חשוב לרפואת רגנרטיבית.
Protocol
1. הכנת צלחות תרבית רקמה
- מעייל אחד גם עם מספיק פולי-D-ליזין (PDL) כדי לכסות את תחתית הבאר. לאפשר את הצלחות לייבוש במכסת המנוע.
- לאחר שהבארות יבשות, לשטוף עם מים סטריליים, ולשאוב. לאפשר את הצלחות לייבוש במכסת המנוע.
- כאשר, מעייל יבש עם פיברונקטין (שהומס במי biowhittaker לילה על 37 מעלות צלזיוס בריכוז של 1 מ"ג ב6 מ"ל).
- הוסף בינוני NCSC [95 מ"ל DMEM/F12, 1 המ"ל פן / דלקת (P / S), 1 המ"ל N2, 2 B27 מ"ל, mercaptoethanol μl 100 (2ME; 50 מניות מ"מ), bFGF (20 בינוני ng / ml), IGF -1 (20 ng / ml של מדיום) וEGF (20 ng / ml של מדיום)] לפני פיברונקטין היבש בצלחות,
2. לחלץ תאי זקיק שיער מקרקפת אנושית
- לפני שתתחיל בהליך של NCSCs המבודד, צריך להכין את מדיות ומגיב בהתאמה (ראה טבלה 1).
- עור רענן מבוגר אנושי קרקפת מנהלים מתיחים פנים או פהרקמת קרקפת טל היא נאספה, נשטפה עם PBS המכיל פניצילין-סטרפטומיצין.
- אז העור מועבר לתוך צינורות 50 מ"ל וטופח DMEM עם Dispase (10 מ"ג / מ"ל) הלילה ב 4 ° C. ° C דגירה של 2-4 שעות ב 37 היא גם יעילה. חתיכות עור צריכות להיות רוחב מרבי של 1 סנטימטר כדי לאפשר לאנזים לחדור.
- להעביר את העור לתוך צלחת פטרי לעקר; למשוך את כל שיער מעור על ידי אחיזת השערה הקרובה לפני שטח העור ומושך בחוזקה וחלקה. זקיקי השיער להראות מורפולוגיה של שתי anagen (איור 1 א) או טלוגן (1B איור).
- דגירת ברי הזקיק הבודד ב0.05% טריפסין-EDTA (Invitrogen) במשך 15-20 דקות בטמפרטורת חדר עם הרעד מהעת לעת, להוסיף 4 המ"ל DMEM עם 10% FBS לעצור תגובה. אפיתל הזקיקים הוא trypsinized ומסונן דרך 40 מיקרומטר סינון כדי לקבל השעית תא בודד המכילה תאים של גודל וצורה שונות.
- לטוותב 200 XG למשך 5 דקות, להשליך supernatant זהירות, מחדש להשעות ב1 המ"ל PBS המכיל 2% סרום (FBS).
- לחלופין, זקיקי שיער מרוט יכולים להיות ממוקמים בתרבות ללא עיכול טריפסין לגדול תחומי שיער באתר.
3. בידוד של NCSCs זקיק השיער באמצעות מיון תא זרימת Cytometric
- השעית זקיק שיער תא בודד התקבלה על ידי עיכול טריפסין ומתויגת עם נוגדנים נגד CD271 (APC מצומדות) / HNK1 (FITC מצומדות) או CD271 / alpha4 integrin (PE-מצומדות) עבור 40 דקות על קרח בחושך.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת חדר ולשאוב supernatant.
- תאי resuspend ב PBS המכיל 2% סרום (FBS), ולפני המיון, PI מתווסף לשער את התאים המתים.
- בצע מיון תא על ידי cytometry זרימה (FACS). איסוף CD271 +, HNK1 + תאים חיוביים כפולים או CD271 +, alpha4 integrin + תאים חיוביים כפולים (איור 2).
- לאחר מיוןing, CD271 +, HNK1 + תאים חיוביים כפולים או CD271 +, alpha4 integrin + תאים חיוביים כפולים מתורבתים בצלחות התקשרות נמוכות במיוחד במדיום NCSC
4. תרבות של NCSCs הראשוני
- תרבות תאי זקיקי המנותקים או FACS מיון תאים בצלחות התקשרות נמוכות במיוחד במדיום NCSC, לשנות בינוני כל יום.
- בדקו תרבית תאים בכל יום תחת מיקרוסקופ. NCSCs יתחיל ליצור אגרגטים קטנים צפים לאחר מספר ימים ותחומים בנויים היטב ב2-5 שבועות בתרבות, בהתאם לגילם של התורמים (איור 3 א). התולדה תופיע בכמה ימים באזור הבליטה וספירות בנויות היטב בהאתר בכמה שבועות (איור 3 ב '), כאשר זקיקי שיער כולו הם בתרבית במדיום NCSC.
5. הרחבת NCSCs
- שטוף תאים עם PBS פעם אחת.
- הוסיפו מחומם מראש (עד 37 מעלות צלזיוס, ביקורתי) accutase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10דקות עם הרעד מהעת לעת כדי להפוך את תחומי תאי גזע עצביים בטוחים ניתקו לתוך תא בודד (לNCSC המצורף תרבותי, תאי אינקובטורים עם accutase על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להפוך לתאי גזע זקיק שיער בטוחים מנותקים).
- שטוף וסרכזת תאים פעמים למשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר בDMEM/F12 בינוני כדי להסיר כל פתרון accutase נותר.
- Re-להשעות תאים עם מדיום התרבות NCSC.
- לתרבות הצפה, לשים את התאים בצלחות התקשרות נמוכות במיוחד. לתרבות מצורפת, לשים את התאים בתרבית רקמת pretreated צלחות.
6. נציג תוצאות
מדיום תרבות NCSC הוא מספיק כדי לשמור hNCSCs במדינה מובחנת ללא צורך בתאים מזינים. הקרטינוציטים לא יתרבו ומתו בהדרגה במדיום. תאים קטנים ועגולים מסוימים להתרבות וליצור אגרגטים קטנים בהשעיה לאחר 3 עד 5 ימים. אגרגטים צפים אלה הגדילו לאטגודל n, מבנים שנוצרו בשלושת ממדי מרחב דמוי, שאנו נקראים תחומי שיער (איור 3 א). אם בתרבית בצלחות מצופות, את NCSCs יהיה לצרף אל פני השטח ולא בצורה כל תחומים. את NCSCs המצורף לגדול מהר יותר מאשר בהשעיה. תאי גזע יוצרי כדור או מצורפים להביע סמני NCSCs. כאשר זקיקי שיער כל תרבויות, ספירות נוצרות באזור המקביל לאזור הבליטה (איור 3 ב ').
איור 1. קטף אנגן () וטלוגן (B) זקיקי שיער.
איור 2. תמונות מייצגות של ניתוח FACS של NCSCs פנל שמאלי.: תאים מגודרות באמצעות 4 נוגדני integrin אנטי CD271 ואנטי alphe. לוח ימני: תאים מגודרים באמצעות נוגדנים אנטי CD271 ואנטי HNK1.
איור 3. מורפולוגיה של תחומי שיער () מורפולוגיה של תחומים צפים שיער, פנל שמאלי:. צריכת חשמל נמוכה, פנל ימני:. הספק גבוה (B) מורפולוגיה של תחום שיער באתר באזור הבליטה, הפנל שמאלי: תחום שיער בבליטת telogen, לוח ימני: תחום שיער באזור הבליטה של זקיק שיער anagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות הבידוד ותרבות התאים שתוארו הן לשעתק ויציבות. לנו שנוצרנו NCSCs מעשרות אנשים ברחבי טווח גילים רחב. למרות זאת הוא הכי טוב לעבד את הרקמה מייד לאחר קציר רקמה, מצא כי רקמות קרקפת יכולות להיות מאוחסנות בבטחה בתקשורת על קרח לתחבורת לילה עם השפעה מינימאלית על כדאיויות תא.
חשוב לטיפול ברקמת הקרקפת באנטיביוטיקה ולהשתמש בטכניקת aseptic במהלך בידוד זקיק שיער כדי למנוע זיהום מיקרואורגניזם פוטנציאלי. עור הושלך מתיחת פנים או מאה עובריים קרקפת רקמות תשואות של זקיקי קיימא ובדרך כלל לייצר מספיק רקמות למיון FACS או ניסויים נוספים במספר ימים בלבד. ביופסיה של רקמת קרקפת בדרך כלל מייצרת מספר מוגבל של תאים ורקמות דורשת תרבות נוספות לייצר תאים מספיקים לניסויים נוספים.
NCSCs העוברי להצמיח ריבוי שונהסוגי תאים בגוף 11, נראה כי שיער זקיק NCSCs נגזר גם יש קשת רחבה של יכולת בידול. בליטת שיער היא הנישה לסוג אחר של תאי גזע 3,12. לייל ועמיתיו הראו בבידוד בתאי גזע אפיתל אדם מבליטת שיער והתאים אלה הם מרובים עצמה לאורך שושלות אפיתל 13. מבשרי מלנוציט גם מתגוררים בבליטת השיער 3. לכן זה אפשרי בו זמנית לבודד אוכלוסיות שונות של תאי גזע על ידי תאי שיער culturing זקיק המופקים במדיומים עם סוג אחר של גורמי גדילה. תאי גזע שמקורם זקיק שיער הם מקור מבטיח לטיפולים בתאי משובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH R01AR054593 וR01AR054593-S1 לשו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Table 1. |
|||
References
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
