Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Autolog Endothelial stamceller-sådd Teknik och biokompatibilitet testning för Hjärt-enheter i stora djurmodell

doi: 10.3791/3197 Published: September 9, 2011

Summary

En metod för sådd titan blod-kontakt biomaterial med autologa celler och testning biokompatibilitet beskrivs. Denna metod använder endotelceller progenitorceller och rör titan, seedad inom några minuter av kirurgisk implantering i svin venae cavae. Denna teknik kan anpassas till många andra implanterbara biomedicinska enheter.

Abstract

Implanterbara hjärt-enheter är tillverkade av konstgjorda material (t.ex. titan (Ti), expanderad polytetrafluoretylen), som utgör en risk för thromboemboli bildas 1,2,3. Vi har utvecklat en metod för att linje insidan av Ti rör med autologt blod som härrör från människa eller svin endotelceller progenitorceller (EPC) 4. Genom att inympa Ti rör som innehåller en sammanhängande lager av svin EPC i underlägsna hålvenen (IVC) av grisar, testade vi den förbättrade biokompatibilitet för cell-seedade yta i protrombotisk miljön av en stor djurmodell och jämfört den med omodifierade rena metallytor 5,6,7 (Figur 1). Denna metod kan användas för att endothelialize enheter inom några minuter efter implantation och testa den antitrombotiska funktion in vivo.

Perifert blod har erhållits från 50 kg Yorkshire svin och mononukleära celler bråkdel odlas för att isolera EPC 4,8. TI rör (9,4 mm ID) var färdigskurna i tre 4,5 cm längsgående sektioner och ihop med krympslang. En sådd enhet byggdes, vilket möjliggör för långsam rotation av Ti rören.

Vi gjorde en laparotomi på grisar och externaliserats tarmen och urinblåsan. Sharp och dissektion användes för att skeletonize de IVC från bifurkation distalt höger njurartären proximalt. Ti rören var då fyllda med fluorescerande-märkta autologa EPC fjädring och roteras 10 RPH x 30 min för att uppnå en enhetlig cell-beläggning 9. Efter administrering av 100 USP / kg heparin, var båda ändarna av IVC och lumbala ven fastklämd. En 4 cm veinotomy utfördes och enheten in och fyllt med fosfatbuffrad saltlösning. Som veinotomy avslutades med en 4-0 Prolene kör suturer och var en klämma bort för att de-luft IVC. I slutet av förfarandet, var fascia approximeras med 0-PDS (polydioxanone suturer) avslutade subkutan utrymme med 2-0 Vicryl och huden häftade stängd.

Efter 3 - 21 dagar, svin avlivas, enheten explanterade en-block och fast. Ti rören var demonteras och insidan avbildade med ett fluorescerande mikroskop.

Vi fann att den nakna metallen Ti rör helt ockluderade medan EPC-seedade rör förblev patent. Vidare kunde vi visa ett sammanhängande lager av EPC på insidan blod-kontakt yta.

Sammanfattningsvis kan vår teknik användas för att endothelialize Ti rör några minuter efter implantation med autolog EPC för att förhindra trombos av apparaten. Vår kirurgisk metod medger provning förbättrad biokompatibilitet sådan modifierad utrustning med minimal blodförlust och EPC-seedade yta störningar.

Protocol

1. Endothelial stamceller isolering

  1. Trettio dagar före EPC-seedade rör implantation, förbereda en 60 ml spruta med 15 ml av antikoagulantia citrat glukoslösning och säkra med en 3-vägs stoppa kuk för EPC isolerade från perifert gris blod. 24 timmar innan blodet rita, precoat två 12-brunnars plattor med typ 1 råtta kollagen (50 mikrogram / ​​ml, löst i 0,02 N ättiksyralösning) 4.
  2. Genomföra alla djuromsorg och experiment i enlighet med National Institute of Health riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och endast efter godkännande av tillsynen Institutional Animal Care och användning kommittén.
  3. Stillsam en kvinnlig Yorkshire gris (45 kg) med acepromazin (1,1 mg / kg) och ketamin (22 mg / kg) intramuskulär via en 19 G fjäril nål.
  4. Intuberas gris med en endotrakealtub (30 cm lång, 8 mm ID) och bedöva grisar med isofluran (4,5% av tidalvolym med mask).
  5. Övervaka grisen under förfarandet genom att mäta syremättnad, hjärtfrekvens och temperatur. Behåll thermoregulation med hjälp av en automatiserad uppvärmd operationsbordet och värme filt och genom att värma den infunderade vätskor.
  6. Placera grisen i ryggläge på operationsbordet, säkerställa dess bakbenen caudolaterally, och rent med klorhexidin följt av DuraPrep sterilisering. Fortsätt sedan med drapering bäckenområdet.
  7. Sätt en 21 G x 7 cm nål från en 5 F mikro-introduktör kit bara mediala till en påtaglig femoral puls (medial till vastus medialis och laterala till gracilis muskel) i lårbenshals ven och cannulate venen med Seldinger teknik. Anslut förberett 60 ml sprutan med intravaskulära katetrar och dra 45 ml blod.
  8. Håll trycket på fartyget punktionsstället för att uppnå hemostas (5 min), avbryta anestesi och återhämta grisen. Djuret övervakas tills fullständig återhämtning och återvände till sin bur.
  9. Späd 1:01 blodet lösning med Hanks buffrad saltlösning (utan CaCl 2, 2 MgCl, MgSO 4) och lager på lika volymer av Histopaque att skapa väldefinierade lager. Centrifugera (30 min, 740 g, låg break inställning) och samla mononukleära celler (MNC) lager. Resuspendera och tvätta multinationella företag x 3 med Dulbecco är Fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) (10 min, 515 g) innan plätering i två 12-brunnars plattor i full tillväxt medium (EBM-2 medium med 2% Svinserum (PS) och EGM-2 SingleQuots) vid 37 ° C, 5% CO 2.
  10. Sakta förändras medelstora per 24 timmar under de första 7 dagarna, därefter varannan dag. Identifiera EPC kolonier efter en genomsnittlig tid
    på 7 dagar (Figur 2).
  11. Expandera EPC i kultur när de täcker ¼ av 12-bra yta. Bekräfta EPC identitet med flödescytometri genom att testa för förekomst av ytan markörer CD31 och frånvaro av CD14, CD45. Andra tester som kan utföras inkludera cellmorfologin och kväveoxid III aktivitet efter exponering för flöde 4.

2. Titanium slang

  1. § en Ti rör längden i 3 lika 120-graders-enheter (4,5 cm lång) med 72 tänder HHS skär såg hålls på plats av en såg berså i en vertikal fräsmaskin. Kör den på 300 rpm och håller skärområdet mättad med Tap Magiska skärvätska vid alla tillfällen under snittet (Figur 3).
  2. Polska insidan med en bänkslipmaskin och en Scotch-Brite metallbearbetning hjul. Sedan manuellt polera med 3M smärgelduk för att ytterligare slät och jämn yta för att ta bort alla synliga gropar.
  3. Rengör Ti bitar med Alconox tvållösning, följt av 5 min nedsänkning i kungsvatten (1:3 koncentrerad salpetersyra mot koncentrerad saltsyra), följt av sköljning med flera liter vatten 10. Extremt försiktig som kungsvatten är starkt frätande och potentiellt explosiva!
  4. Sonikera Ti delar x 16 min i Alconox tvållösning, stiger x 30 i avjoniserat vatten och låt ligga igen x 16 min i avjoniserat vatten. Låt torka i laminärt flöde huva.
  5. Klipp PVC krympslang till 4,5 cm längd och rengör per 2,4.
  6. Använd pincett för att placera 3 rengöras Ti sektioner på en stödjande dorn (svarvade ur aluminium, 8,5 mm OD) och placera hylsa av PVC krympslang runt Ti sektioner (Figur 4). Krympslang med en värmepistol samtidigt som du vrider dorn jämnt linda Ti sektioner tätt tillsammans.

3. Seedning enheten och komponenten montering

  1. Klipp silikonslang till en längd av 2,5 cm och 3,5 cm.
  2. 5 § cc plastspruta på 0,8 ml-strecket och hålla "huvudet pjäs" med luer slut.
  3. Rengör 2 x silikon sektioner, spruta huvud bit "och ett Luer lock av ultraljudsbehandling som beskrivs under 2.4.
  4. Lägg silikonslang i varje ände av sammansatta Ti röret från 2,5, omfattandeding med 5 mm över PVC-slang.
  5. Sätt avskurna ändan av sprutan "huvud bit" i korta silikonslang, så att det gränsar Ti rör (Figur 5).
  6. Seal färdiga Ti slang med en luer-keps i Tyvek påse och gas-sterilisera med etylenoxid (18 timmar vid 55 ° C).
  7. Montera en synkron timing motor (10 RPH) på ett plexiglas plattform och ansluta sin axel till en spruta hållare (bearbetade i aluminium, passar 5 cc spruta) (Figur 6).

4. EPC-sådd av Ti rör insidan

  1. Expandera EPC som isolerats under 1. Till 3 konfluenta T-75 flaskor (eller åtminstone 9 x 10 6 celler).
  2. På dagen för operationen, fluorescerande etikett celler med långsiktiga färgämne (PKH26) 11. Börja med att skölja odlade EPC två gånger i serum fritt medium. Försiktighet för att begränsa ljusexponering för att skydda cellerna under och efter märkning.
  3. Täck celler med 4 mikroM PKH26 i spädmedel C (färglösningen) i rumstemperatur i 4 minuter.
  4. Sluta märkning reaktionen genom att tillsätta Svinserum i lika stor mängd att färga lösning. En minut senare, späd kombinerad lösning 1:1 med full tillväxt medium.
  5. Aspirera vätskan och skölj celler x 3 med full tillväxt medium.
  6. Tvätta EPC två gånger i DPBS (utan CaCl 2, MgCl 2).
  7. Täck celler i trypsin och inkubera vid 37 ° C i 3 minuter och bekräfta lossnar under ett ljusmikroskop. Lägg Trypsin Neutralisering Solution i dubbla volymen används av trypsin.
  8. Kombinera cell lösningar i en enda rör och blanda genom att pipettera. Tillsätt 10 l av cell-lösning i varje sida av en hemocytometer för räkning.
  9. Centrifugera cell-lösning (1500 RPH, 5 min.). Räkna celler och resuspendera pellets vid 2 - 2,5 x 10 6 EPC / ml i serum fritt medium. Notera den minsta volym för att fylla slang är 4,5 ml.
  10. Lägg ut steril handduk i biologiska huva för sterila fältet. Öppna gas-steriliserade Ti slang och extra 5 cc sprutan sterila fältet.
  11. Med sterila handskar, ta bort kolven från 5 cc spruta och hålla på fältet för senare användning. Fäst Luer lock till denna spruta.
  12. Pipettera på 4,5 - 5 ml EPC suspenderade i 4,9 i det öppna sprutan. Sätt kolven säkert tillbaka in i öppna änden av sprutan.
  13. Håll sprutan med lock uppåt och ta bort locket. Sätt spruta med luer-änden först till öppna silikonslang av Ti slang tills tätt, inte förskott inom Ti rör.
  14. Advance kolven långsamt tills cellen lösning når toppen av skär spruta huvud pjäs, "ta bort bubblor från systemet. Avsluta med luer-lock och sätt in hela församlingen till sterila slida, tätning öppna änden med tejp.
  15. Sätt hela denna församling in i bearbetad spruta innehavaren av 3,7. Placera i inkubator vid 37 ° C och anpassa plattformen så att Ti tub del av seedning kammaren nivå, med hjälp av mätare vattenståndet (Figur 6).
  16. Låt Ti slang för att rotera 30 minuter före implantation.

5. Implantation av Ti slang in svin sämre hålvenen

  1. Tjugofyra timmar före operation, premedicate grisen (från vilket EPC var isolerade) med ett fentanylplåster (100 mikrogram / timme depotplåster, hålla plåstret på plats x 72 timmar).
  2. Håll gris NPO natten och administrera Baytril (Enrofloxacin) preoperativt på operationsdagen (5 mg / kg, IM) och i 7 dagar efter varje 24 timmar som antibiotikaprofylax.
  3. Stillsam, intuberas och bedöva grisen som beskrivs under 1,3 (tidalvolym på 10 -15 ml / kg) och säkra grisen i liggande position på operationssalen bordet. Övervaka grisen under förfarandet genom att mäta syremättnad, hjärtfrekvens och temperatur. Behåll thermoregulation med hjälp av en automatiserad uppvärmd operationsbordet och värme filt och genom att värma den infunderade vätskor.
  4. Sätt en 18 G IV kateter i grisens öra ven och skydda grisens ögon med Vetropolycin ögondroppar.
  5. Ren, prep och drapera grisens buk som i 1,6. Incise mittlinjen med en # 15 skalpell blad från 2: a uppsättning av bröstkörtlar cranially till den 2: a till senast inställda caudally.
  6. Bär dissektion ner till buken fascia med diatermi.
  7. Lyft bukhinnan med Mosquito pincett, och försiktigt in den med Metzenbaum sax.
  8. YTTRE urinblåsan och placera en 3-O Vicryl handväska sträng sutur i blåsväggen. Placera en dolkstöt snitt i dess mitt och för in en 16 F Foley kateter. Administrera intravenös vätsketillförsel (Laktat Ringers) för att titrera urinutsöndring> / = 1 ml / kg / timme under operationen.
  9. Efter, YTTRE de små och stora tarm och lägg två Balfour kirurgiska upprullningsdon att exponera den bakre delen av bukhålan och identifiera de underlägsna hålvenen (IVC).
  10. Använda skarpa och dissektion, noggrant befria IVC från omgivande vävnad och skeletonize fartyget från höger njurartären proximalt om bifurkation av IVC distala. Var extremt försiktig under IVC dissekering som även en mycket liten defekt i IVC kan leda till en snabb blödning och exsanguination av djuret.
  11. Ligate alla sidogrenar av IVC segmentet för att säkerställa att det inte blir någon blödning runt Ti röret att implanteras. Notera den oftast stora två bakre ländryggen nerver som kräver mycket noggrann dissekering och ligatur. Vidare noterar att omedelbart proximalt om bifurkation av IVC är ett stort ländryggen ven vanligt förekommande på posteromedial sidan och måste dissekeras fri och kontrolleras med fartyg loopar inför klämma placering.
  12. Fortsätt med sådd Ti röret samtidigt som beskrivs under 4.
  13. Administrera 100 USP / kg av heparin omedelbart före fastspänning av IVC. Placera 45 graders vinkel kirurgiska klämmor distalt på IVC och ländrygg ven och sedan proximalt.
  14. Skapa en longitudinell veinotomy (4 cm) mellan den proximala och distala klämmor med en # 11 skalpell blad följt av förlängningen med Potts sax.
  15. Evakuera blod från IVC och spola dess inre lumen med sterilt DPBS.
  16. Nu sätts EPC-seedade Ti röret (eller en ren metall-kontroll) i IVC och fyll den med DPBS (med CaCl 2, MgCl 2) för att förhindra att celler från uttorkning och för att evakuera luft.
  17. Stäng veinotomy med 4-0 Prolene kör sutur och ta bort en proximal klämma till de-luft IVC via en liten back-blödning. Placera en "stay-sutur" genom venen väggen i PVC-slangar för att förhindra migration av implantatet över tiden.
  18. Stäng fascia med O-PDS på en CT-nålen och subkutan utrymme med 2-O Vicryl (körs suturer). Stäng huden med klammer.
  19. Administrera upp till 20 ml 0,25% Marcaine (Bupivakain) subkutant längs snittet webbplatsen och täcka såret med gasbinda och Tegaderm. Också ge Flunixin (2,2 mg / kg Q 24 tim) och oxymorfon (0,15 mg / kg Q 3 till 4 timmar) subkutant som behövs för smärta.
  20. Avbryt anestesi, övervaka grisen tills vakna och gå tillbaka till buren. Övervaka gris två gånger dagligen för tecken på obehag / smärta, stående och förflyttningar, avföring och urin-utgång, och hudfärg indikerar normal perfusion.

6. Borttagning av Ti tub

  1. Efter 3 veckor, stillsam, intuberas och bedöva grisen som beskrivs i 1,3 till 1,4.
  2. Fortsätt med en laparotomi som beskrivs i 5,5 till 5,8.
  3. Observera att ärrbildning kommer att dölja implantatstället men du kan palpera den styva Ti röret på plats.
  4. Dissekera ut IVC som beskrivs i 5,9 till 5,11 och Explantation Ti rör en-block med det omgivande IVC med tunga sax.
  5. Euthanize djuret med Euthasol dödshjälp lösning (390 mg / ml Pentobarbital Natrium och 50 mg / ml fenytoinnatrium på 1 ml / 10 kg).

7. Fixering och bildbehandling Ti insidan

  1. Skölj exciderad ven segmentet med Ti rör i DPBS lösning och fotografi dess lumen (patent eller ockluderade) med en högupplöst digitalkamera (Figur 7).
  2. Efter, fixa provet genom nedsänkning i 3,7% paraformaldehyd i minst 15 minuter. Skölj provkroppen i DPBS lösning.
  3. Mycket noggrant incise omgivande ven och PVC-slangar för att öppna Ti röret. Placera 3 sektioner under ett fluorescerande mikroskop med insidan ytor som vetter mot mål / ljuskällan och bilden under 550 nm excitationsvåglängden att visualisera PKH26-märkta EPC i röd / orange färg (Figur 8A). Om så önskas kan cellerna ytterligare färgade (t.ex. Platelet endotelceller Adhesion Marker (PECAM)-bets att visualisera cellkantlinjer (Figur 8B), DAPI-bets att visualisera kärnor, etc.).

8. Representativa resultat:

Efter genomförandet av detta protokoll, läkare och forskare har möjlighet att endothelialize fast röret strukturer med autolog blodbaserade endotelceller stamceller i ett stort djur-modell. Figur 2 visar att EPC isolerade med vår metod visas som kolonier med kullersten morfologi efter ca 7 dagar i kultur. Vår sådd anordning som illustreras i Figur 5 och 6 tillåter långsamma rotation av Ti rör fyllda med EPC fjädring och resultat i jämn täckning av rörets inre yta under sterila förhållanden 9.

Vår implantationskirurgi medger provning benägenheten av biomaterial, såsom Ti, för trombos i en stor djurmodell. Vi fann att grisar tolererar detta förfarande väl och att detta implantation kan uppnås med endast minimal blodförlust och utan EPC lager störningar.

t "> Figur 7 visar att en naken Ti röret helt occludes, medan våra EPC-fodrade röret förblir patent även i protrombotisk låg skjuvning miljö sämre vena cava. Vidare bekräftar förekomst av ett sammanhängande skikt av fluorescerande-märkta celler i Framgången för denna metod som visas i Figur 8.

Figur 1
Figur 1. Schematisk av autologt endotelceller stamcellstransplantation (EPC) sådd experiment. För det första är perifert blod från en gris. Vidare är EPC isoleras ur blod och expanderade i kulturen. EPC används sedan för att linjen en titan (Ti) tub-enheten, som sedan inopererade i sämre hålvenen av samma gris från vilka celler som var isolerade.

Figur 2
Figur 2. Representant koloni av EPC i kultur, ca 7 dagar efter Isoleringsförfarande (avbildade med ett inverterat Leica DMIL mikroskop med kamera och QCapture programvara).

Figur 3
Figur 3. Ti röret avsnitt före montering. Ti slangen är skuren i tre lika stora delar på längden, och sedan kapas till 4,5 cm längd. Inre ytor Ti avsnitten är polerad med en bänkslipmaskin och smärgelduk för att ta bort synliga gropar.

Figur 4
Figur 4. Montering av Ti slang sektioner med PVC-krympslang (blå) och värmepistol. Ti delar stöds på en bearbetad aluminium dorn som sträcker sig genom Ti sektioner och matchar måtten på Ti röret innerdiameter.

Figur 5
Figur 5 Titanium slang, som visar alla komponenter:. Luer mössa, spruta huvud pjäs, "silikonslang, och Ti rör med PVC-wrap (blå). Monteringen är sammanställt före sterilisering för kirurgisk användning.

Figur 6
Figur 6. Ti rör sådd installation inuti inkubator, som visar motor, plattform, bearbetad innehavaren aluminium spruta, Ti slang, och 5 cc spruta. Obs: Montering visas utan skyddande sterila slida för visualisering ändamål.

Figur 7
Figur 7. Representant grov resultat av implantation kirurgi. (A) End-view-kontrollen ren metall Ti röret efter implantation i svin underlägsna hålvenen (IVC). Tube lumen är helt blockerad med en solid blodpropp.. (B) Slutet bild av EPC-seedade Ti röret efter implantation Tube lumen är helt patent och tydligt. (C) dissekerade syn på kontroll (kala) Ti röret efter 3 dagars implantation, som visar omfattningen av trombos (experiment utfördes upp till 3 veckor med samma resultat).

Figur 8
Figur 8. EPC på Ti röret ytan efter 3 dagars implantation (avbildade med en upprätt Leica DMRB mikroskop med en QImaging QICAM svartvit digitalkamera och Image Pro Plus-programvara). (A) konfluenta celler på ytan visar PKH26 innan operation märkning. (B) konfluenta lager av EPC. Röd: PKH26 innan operation märkning. Grön: EPC PECAM-fläcken.

Discussion

Metoden för cell-sådd Ti rör som presenteras här gör att läkare och forskare att snabbt och enhetligt endothelialize blod-kontaktytorna implantat. Eftersom vi isolera och expandera EPC från perifert blod prov, är ingen större invasiv förfarande som krävs för att skörda dessa celler. Dessutom EPC är autolog, och därför är risken för att immunreaktion till den cell-seedade implantat elimineras. De principer som visat i hans protokoll kan utnyttjas inte bara för Ti rör, men för många andra biomaterial som används vid hjärt-medicin.

Kritiska steg i detta protokoll är noggrann rengöring av Ti rör, då vi fann att några anhängare film av föroreningar kompromisser cell följsamhet. Dessutom är en långsam rotationshastighet (omvänt proportionell mot rörets diameter) väsentligt under sådd processen, kan så att EPC bosätta långsamt och hålla sig till ytan som Ti röret är i rörelse.

Vår metod för sådd omedelbart före implantationen undviker opraktiskt ex gånger vivo kultur; celler följer individuellt och senare bildar en sammanhängande blad in vivo, undvika att i embolisering som ett ark omedelbart efter återupprättandet av flödet. Våra tidigare studier visar att när EPC har vuxit till ett sammanhängande lager, de gör en extracellulär matrix som de absolut måste, dessutom minimera eventuella sårskorpa av en endothelial ark. Även möjligheten att emboli lossnar inte helt kan uteslutas, verkar det vara mångfacetterat lägre risk än trombos för hela enheten ytan, problemet är att denna behandling är utformad för att förhindra.

Vår strategi för implantering i den låga skjuvning, använder protrombotisk miljö underlägsna vena cava en av de mest betrodda stora djurmodeller för forskning blod kompatibilitet och trombos av enheter 5,6. Observera att alla djurvård och experiment har utförts i enlighet med National Institute of Health riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och endast efter godkännande av Duke University Institutional Animal Care och användning kommittén.

För att framgångsrikt utnyttja denna implantation metod för att testa biomaterial och enheter, är det viktigt att tålmodigt skeletonize de IVC segmentet och ligate alla fartyg venös filial i förberedelse för enhet insättning, så att ingen blödning runt enheten har sitt ursprung i ett "falskt lumen. Ett annat viktigt steg är att tillsätta DPBS in i enheten lumen så att cellerna på insidan röret ytan förblir fuktig under stängningen av veinotomy och innan reperfusion inleds. Om enheten inte kan hittas på den plats där den inopererad, kan det ha migrerat "tidigare i IVC. Detta kan förebyggas genom att placera en sutur (4-O Prolene) genom venen väggen och genom en 2 - 3 mm avsnitt av PVC-slangar så att slangen är fast förankrad i sin nuvarande plats. Om forskaren har svårt att hitta fluorescerande pre-märkta celler visas i Figur 8 efter borttagning i en annars patent tub, är det troligt att cellerna har skalats av som en sammanhängande ark. Detta kan förhindras genom mycket försiktig dissektion av det omgivande ven och dis-montering av tre Ti röret avsnitt, efter fastställande av ven tillsammans med röret.

Vår teknik ger proof-of-concept för att förebygga hjärt-enhet trombos via EPC-sådd. Denna teknik kan användas i utvecklingen av "biogena" implantat fodrad med patientens egna endotelceller progenitorceller. Förstudien i vår svin djurmodell ger för första stegen mot översättningen av denna "personlig medicin" i klinisk praxis.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Leica Microsystems för deras värdefulla råd om bildbehandling titan sektioner och Gemini Bio-produkter för att ge Svinserum används i denna studie. Vi vill också tacka NIH för deras stöd genom Grant "Autolog EPC foder för att förbättra biokompatibilitet av cirkulationsrubbningar hjälpa enheter", RC1HL099863-01. Vidare är vi tacksamma för National Science Foundation Graduate Research Fellowship stöd av Alexandra Jantzen. Vi vill också tacka George Snabb, Mike Lowe och Ianthia Parker för att hjälpa till med många aspekter av det kirurgiska ingreppet och hantering av vår forskning djur. Steven Owen har varit ovärderligt när bearbetning många delar av vår sådd enheten och skär titanrör.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acepromazine Boehringer Ingeheim BIC670025 NAC# 10280002
Alconox Powered Precision Cleaner Alconox, Inc. 1104
Balfour Surgical Retractor Adler N/A
Baytril Bayer AG APVMA 46028/0705
Butterfly Needle (19G) Terumo Medical Corp. SV19CLK
Chlorhexidine 3M 9200
Clamps (45-degree) Aesculap FC339T
DPBS (-/-) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
DPBS (+/+) GIBCO, by Life Technologies 14040-133
DuraPrep 3M 8635
EBM-2 Medium Lonza Inc. CC-3156 Base for both serum free and full growth medium
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. CC-3162 Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium
Electrocautery Tool Valleylab SurgII-20
Emery Cloth 3M 60-0700-0425-8 240 grit
Euthasol Euthanasia Solution Virbac Animal Health ANADA #: 200-071
Fentanyl Patch Actavis NDC # 67767-120-18
Flunixin Merck & Co. NAC #: 10470183
Foley Catheter (16F) Bard 730116
HBSS Sigma-Aldrich H8264-500ML
Heat Gun Milwaukee 8988-20
Heparin NDC #: 25021
Histopaque-1077 Sigma-Aldrich H8889-500ML
Intubation Tube Mallinckrodt Baker Inc. 86113
Isoflurane MWI Veterinary Supply NDC #13985-030
IV Catheter (18G) BD Biosciences 381547
Ketamine Fort Dodge Animal Health NDC #0856-2013
Level Swanson LLA001
Luer-Lock tip cap CML Supply 909-001
Marcaine Hospira Inc. NDC #: 0409-1560-10
Metzenbaum Scissors Adler N/A
Micro-introducer (5F) Galt KIT 002-01
Mosquito Forceps Adler N/A
Motor Herbach and Rademan H1-08
Oxymorphone Endo Labs NDC: 63481-624-10
PKH26 Dye Kit Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
Porcine Serum Gemini Bio Products 100-115 2% concentration in full growth medium
Potts Scissors Adler N/A
Precise Vista Skin Stapler 3M 3998
PVC Tubing McMaster-Carr 7132K117 expanded ID 15.88 mm,
recovered ID 7.95 mm
Right Angle Medium Size Adler N/A
Scalpel Blade (#10-15) Bard 373910
Silicone Tubing McMaster-Carr 51735K26 16.64 mm OD, 9.52 mm ID
Syringe (5 cc) BD Biosciences 309603
Tegaderm 3M 90001
Three-way Stopcock Kendall 170060
Ti Tube Tico Titanium N/A Specified as ½" OD, .065" wall, .370" ID, .1737 lbs/ft
Trypsin Lonza Inc. CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution (TNS) Lonza Inc. CC-5002 0.03%
Vetropolycin Pharmaderm Animal Health NAC #: 12920110
Vicryl Suture (3-0) Ethicon Inc. J808T
Water Bath Sonicator Branson B200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achneck, H. E. Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface. Circulation. 122, 2068-2077 (2010).
  2. Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient. Vascular. 16, 6-13 (2008).
  3. Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium. Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).
  4. Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
  5. Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).
  6. Ueberrueck, T. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. J Surg Res. 124, 305-311 (2005).
  7. Velik-Salchner, C. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thromb Res. 117, 597-602 (2006).
  8. Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. (2010).
  10. Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).
  11. Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking. J Surg Res. 62, 23-28 (1996).
Autolog Endothelial stamceller-sådd Teknik och biokompatibilitet testning för Hjärt-enheter i stora djurmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).More

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter