Summary
Ett alternativt sätt att isolera möss embryonala motoneurons från ryggmärgen beskrivs. Metoden tar hänsyn till det faktum att lektin kan binda till låga affinitet nerve growth factor receptor p75NTR. Denna lektin-baserade preplating ger en reningsanläggning som liknar den som med en specifik antikropp mot p75NTR.
Abstract
Spinal motoneurons utvecklas mot postmitotic etapper genom tidig embryonal nervsystemets utveckling och därefter växa ut dendriter och axoner. Neuroepiteliala celler i neuralröret som uttrycker Nkx6.1 är de unika föregångare celler för spinal motoneurons 1. Även postmitotic motoneurons gå mot sin slutliga position och organisera sig i kolonner längs ryggraden tarmkanalen 2,3. Mer än 90% av alla dessa differentierade och placeras motoneurons uttrycker transkriptionsfaktorer Islet 1 / 2. De innerverar musklerna i armar och ben samt de av kroppen och de inre organen. Bland annat motoneurons uttrycka vanligtvis hög affinitet receptorer för hjärnan neurotrofa faktor (BDNF) och Neurotrophin-3 (NT-3), den tropomyosin-relaterade kinas B och C (TrkB, TrkC). De uttrycker inte tropomyosin-relaterade kinas A (TrkA) 4. Förutom de två hög affinitet receptorer, gör uttrycka motoneurons låg affinitet neurotrophin receptorn p75 NTR. Den p75 NTR kan binda alla neurotrofinernas med liknande, men lägre affinitet till alla neurotrofinernas än hög affinitet receptorer skulle binda den mogna neurotrofinernas. Inom den embryonala ryggmärgen är p75 NTR enbart uttrycks av spinal motoneurons 5. Detta har använts för att utveckla motoneuron isolering tekniker för att rena cellerna från den stora majoriteten av omgivande celler 6. Isolera motoneurons med hjälp av specifika antikroppar (panorering) mot den extracellulära domäner p75 NTR har visat sig vara en dyr metod som den mängd antikroppar som används för ett enda experiment är hög på grund av storleken av plattan används för panorering. Ett mycket mer ekonomiskt alternativ är att använda lektin. Lektin har visat att specifikt binda till p75 NTR samt 7. Följande metod beskriver en alternativ teknik med hjälp av agglutinin vetegroddar för en preplating förfarande istället för p75 NTR antikropp. Den lektin är ett extremt billigt alternativ till p75 NTR antikropp och betygen rening med hjälp lektin är jämförbar med den i p75 NTR antikropp. Motoneurons från embryonala ryggmärgen kan isoleras genom denna metod, överleva och växa ut neurites.
Protocol
För speciella reagens: se Tab. 1. Alla andra börsnoterade reagenser är i cellkultur grade-kvalitet från Sigma Aldrich.
1. PORN-H/laminin beläggning av rätter / täckglas
- Förbered brukslösning på 0,5 mg / ml Poly-DL-Ornithine hydrobromid (PORR-H) i 150 mm boratbuffert pH 8,35.
- En stamlösning av 50 mg PORN / 1 ml boratbuffert kan förberedas i förväg och förvaras vid -20 ° C.
- Sterilisera glas täckglas genom flambering i 100% etanol och låt dem lufttorka.
- Täck ytan med tillräcklig PORN-H-lösning över natten vid 4 ° C.
- På nästa dag tvätta tre gånger med sterilt vatten och lufttorka täckglas.
- Förbered brukslösning på 2,5 mikrogram / ml laminin i HBSS
- Portioner kan lagras vid -20 ° C. Tina vid 4 ° C omedelbart före användning.
- Täck ytan på PORR-H-belagd täckglas med laminin lösningen och låt dem inkubera i minst 2 timmar i rumstemperatur tills det ska användas.
2. Lektin beläggning av reningen plattan
- Bered en lösning av 10 mM Tris i sterilt vatten, pH 9,5.
- Lägg lektin (lösa lektin (Sigma L9640) pulver i HBSS) till en slutlig koncentration på 10 mikrogram / ml.
- Belägga ytan av en 10 cm cellkultur skålen med 8 ml av lektin lösningen och låt den inkubera i minst 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta plattan tre gånger med HBSS och butik i HBSS fram till användningen.
- Förbered en 30mm KCl, 0,8% (w / v) NaCl depolarisering-lösning. Sterilisera genom filtrering och förvara i rumstemperatur (RT).
3. Motoneuron odlingsmedium
- Tina hästserum över natten vid 4 ° C och inaktivera vid 55 ° C i 30 min, Alikvotera i 5 ml och förvara vid -20 ° C. Tina alikvot direkt före användning vid RT.
- Förvara B27-tillskott i 1 ml aliqouts vid -20 ° C. Tina B27 komplettera vid RT omedelbart före användning. Undvik att frysa och tina cykler.
- Alikvotera glutamax till 0,5 ml alikvoter och förvara vid -20 ° C och använd den på 1:100.
- Bered en stamlösning av 10 mikrogram / ml CNTF i sterilt vatten med 0,1% BSA. Förvara vid -20 ° C.
- Blanda 46 ml neurobasal medium med 2,5 ml häst serum, 1 ml B27-tillskott och 0,5 ml glutamax direkt före användning.
- Lägg CNTF till en slutlig koncentration på 10 ng / ml medelstora och förvärma medellång till 37 ° C.
4. Ryggmärgen dissektion
- Offra en E12.5 gravid mus och ta bort embryon noggrant. Lägg tillräckligt RT HBSS för att helt täcka embryon.
- Ta bort huvud och svans och placera sidan embryot tillbaka upp med grenslade lemmar.
- Fäst embryo med en pincett och ta bort den yttre huden med andra pincett.
- Ta bort ryggmärgen genom att sticka hål på pincetten i den och lyft upp med såg-liknande rörelser på båda sidor av ryggmärgen.
- Överför isolerade ryggmärgen till en ny maträtt med HBSS och öppna den centrala kanalen i ryggmärgen på ryggsidan.
- Ta bort dorsalrotsganglier genom att ta bort den omslutande meningerna i ryggmärgen.
- Samla lumbala delar av ryggmärgen upp till 6 embryon per lektin plattan i ett Eppendorf reaktion rör fyllt med 1 ml HBSS och förvara på is tills beredningen gjort är.
5. Berikning av motoneurons av lektin-baserade rening
Obs: Innan du börjar nästa steg, senast här förbereda och prewarm mediet (se steg 3.)
- Förbered en trypsin lösning genom att lösa 1 g Trypsin i 100 ml HBSS, förvara vid -20 ° C och tina vid 4 ° C.
- Blanda 1g trypsin-inhibitor med 98 ml HBSS och 2 ml 1 M HEPES pH 7,4 bör 1 ml alikvoter lagras vid 4 ° C.
- Överför röret med ryggmärgen på en cellkultur huva och försiktigt bort 700 ìl av HBSS.
- Tillsätt 7,5 l trypsin lösning och blanda genom att försiktigt vända röret.
- Utför trypsination för 8 min vid 37 ° C.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 30 l trypsininhibitorerna och pipettera upp och ner (mal sönder) noggrant 10-15 gånger med en 1000 l pipettspets tills inga fler cellaggregat är synliga. Upprepa trituration med 20-200 l pipett och motsvarande spets.
- Pipettera cellen lösningen i HBSS fyllda lektin platta och sprida cellerna genom att försiktigt vrida på plattan.
- Håll lektin plattan i 60 minuter vid RT på en vibrationsfri yta. Täck den för att undvika kontaminering.
- Ta bort HBSS mycket försiktigt och tvätta plattan försiktigt 4 gånger med förvärmda HBSS att ta bort cellen fragment och inte är monterad / lös celler.
- Omedelbart efter sista tvätt, tillsätt 500 l depolarisation lösning på plattan och låt den inkubera under 1 min.
- Underlätta avlossning av lektin bundna celler genom att skaka ochknacka på plattan.
- Fyll tallriken med 2 ml förvärms odlingsmedium och överför till en 15 ml Falcon rör.
- Räkna mobilnummer med ett Neubauer räknekammare.
- Plate cellen på laminin belagda täckglas eller plattor i ett lämpligt antal beroende på tillämpning.
- Utför ett medium utbyte på dag 1 och därefter varannan dag genom att noga utbyte av 50% av det gamla mediet. Använd alltid förvärmas, nylagade nya odlingsmedium.
6. Representativa resultat:
Embryonala motoneurons kan erhållas från musembryon på E12 till E14. 2-3% av den totala cellen befolkningen i ländryggen ryggmärgen består av motoneurons och som dorsala ganglieblockerande nervceller p75 NTR-positiva också, är det viktigt att bli av med dessa celler innan lektin-baserade preplating förfarande ( För översikt se Figur 1 och Figur 2). För det andra hjärnhinnorna inkluderar starkt delande celler som ska undantas också, eftersom de inte kan riktigt bort av lektin-baserade preplating förfarande (figur 2 och 3). I värre fall kan dessa celler växa över kulturen plattorna. Den representativa bilder i figur 3B och 3D ger också en uppfattning om den lägre celltätheten efter tvätt förfaranden har utförts (se steg 5.9 i protokollet). Kulturer av embryonala musen motoneurons är oftast behålls för upp till fem eller sju dagar. Under denna tid cellerna fastställa deras neurites upp till en maximal längd (Figur 4). Neurite längder starkt beroende av underlaget på plattorna 8. Den typiska substrat är laminin som är belagt på PORR-H täckt kultur rätter. Motoneurons kan också växa ut på andra eller mindre definierade ytor, som extracellulära matriser genereras av vatten lys 8. I fall av suboptimala beläggning, neurite längd och tillväxt konen området minskat och celldöd oftast ökar. Trofiska stöd spelar en avgörande roll för överlevnaden av embryonala mus motoneurons i kulturen. Överlevnad initialt pläterade celler på dag sju sjunka till 10% till 20% utan trofiska stöd 6. Brain neurotrofa faktor (BDNF) och ciliär neurotrofa faktor (CNTF) är de vanligaste faktorerna men andra kan främja överlevnaden samt [leukemi hämmande faktor (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9].
Figur 1. Flow system för beredning av embryonala mus motoneurons. Den schematiska ritning illustrerar de olika stegen för isolering och odling av mus-embryonala motoneurons. Förkortningar: SC: ryggmärg; HBSS: Hanks balanserad saltlösning, MN: motoneuron.
Figur 2 Isolering av den lumbala delen av ryggmärgen från E12.5 mus A:.. E12.5 mus embryo. För nästa steg, är huvudet och svansen bort och kroppen är placerad i en dorsal-up läge B: embryo i en dorsal-up läge. Tång på vänster och höger i ryggmärgen fastställande av embryot kroppen i sin ståndpunkt. En av tång därefter används för att skära i huden och minska under ryggmärgen den andra används för att fixera embryo i sin position C:. Isolerade ryggmärgen från E12.5 mus embryo. De delar av ryggmärgen (hals-, bröst-, länd) anges. Ryggmärgen omges av hjärnhinnorna och en del av dorsalrotsganglier fortfarande fäster dem D:. Ryggmärgen är längdriktningen klippa på ryggsidan för att öppna den mot den centrala kanalen E:. Meningerna på den ventrala sidan nu tas bort från den tillplattade ryggmärgen. OBS: Även tas bort, är ländryggen delen markeras av en liten minskning F:. Endast lumbala delen av ryggmärgen tas sedan för ytterligare förfaranden.
Figur 3 Fastställande och isolering av Islet-positiva celler från ländryggen ryggmärg från E12.5 musembryon A:.. Den Islet-1 / 2 antikropp etiketter motoneuron kolumner i embryonala ländryggen ryggmärgen (röd, pil) och Hoechst etiketter alla kärnor inom sektionen. Tvärsnitt av en E12.5 lumar ryggmärgen. E12.5 musembryon var nedsänkning-fast i 4% paraformaldehyd för 6 timmar, tvättade 3 gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning och behandlas med sackaros enligt gällande rutiner. Kryosnitt av 20 ìm tagna med en kryostat och avsnitten behandlades för immunhistochemical färgning enligt standardrutiner 11. Avsnitten porslin märkt därefter med Hoechst för lokalisering av cellkärnor. Notera attden dorsala ganglieblockerande nervceller Islet-1/2-positive så bra och att förberedelserna förfarande utesluter denna vävnad delar från den isolering procedur B:. Islet-1 / 2 märkt (röd, pil) dissocieras ländryggen ryggmärgen celler från E12. 5 embryon, vänster - före och höger - efter lektin-baserade preplating. Cellerna var counterstained med Hoechst att visualisera alla cellkärnor C:. Kvantifiering av Islet-1/2-positive celler före och efter lektin-baserade preplating D:. Nkx6.1 märkt motoneurons från E12.5 embryon efter en dag i kulturen. Cellerna var counterstained med Hoechst att cisualieze alla kärnor. Observera att 90% av alla celler är Nkx6.1 positiva. Förkortningar: SC: ryggmärg, MN: motoneuron; DRG: dorsalrotsganglier ganglion.
Figur 4 Beskrivning av E12.5 mus motoneurons A och B:.. Berikad isolerade E12.5 musen ländrygg motoneurons uttrycka p75 NTR på 0 dagar in vitro (0div) och dag 2 in vitro (2div). Celler har fastställts med 4% paraformaldehyd och därefter färgas för p75 NTR enligt gällande rutiner. Celler counterstained med Hoechst för att visualisera alla kärnor C:. Berikad motoneurons efter 5 dagar in vitro (5div) på PORR-H och laminin som kultur substrat och i närvaro av CNTF färgas för β-III-tubulin. Observera att cellerna har vuxit ur långa neurites och visa den typiska motoneuron morfologi med en längre (grenade) process och en eller flera kortare processer (axoner och dendriter). Förkortningar: MN: motoneuron; div: dagar in vitro.
| Efter dissociation utan lektin-baserade preplating | |||
| Totalt antal celler / SC | Trypan blå-positiva celler [%] | Islet-1/2- positiva celler [%] | |
| 1 | 995,0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889,4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| Medel ± SD | 1.021.0 ± 147,1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| Med lektin-baserade preplating | |||
| Antal celler efter preplating / SC | Trypan blå-positiva celler [%] | Islet-1/2- positiva celler [%] | |
| 1 | 189,6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168,8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125,0 | 0,0 | 72,5 |
| Medel ± SD | 161,1 ± 33,0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
Tabell 1. Sammanfattning av representativa isolering förfaranden för mus embryonala motoneurons från scenen E12.5. Resultat från 3 olika isolering förfaranden särskilt för detta ändamål finns angivna som totalt antal nummer eller nummer procent ± SD. Förkortning: SC: ryggmärg, SD: standardavvikelse.
| Islet-1 / 2 positiva celler med p75 panorering [%] | Islet-1 / 2 positiva celler med lektin-baserade panorering [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
Tabell 2. Jämförelse av lektin-baserade och p75-baserade en panorering nummer motoneuron cellen. Resultaten redovisas i procent siffror ± SD.
Discussion
Fördelen med detta lektin-baserade preplating tekniken är att det är billigare än p75 NTR-baserade panorering förfarande och lectin är mer stabil än antikroppar. Den anrikning som anges i figur. 2 och Tab. 1 visar att förfarandet gör det möjligt för rening av ungefär lika många celler och att en majoritet av dessa celler uttrycker motoneuron markör Islet-1 / 2. Det mest kritiska steget är isoleringen förfarandet för ländryggen ryggmärgen. Ta bort hjärnhinnorna och DRG (Fig. 2) är avgörande för följande rening förfarandet genom lektin-baserade preplating. Om detta har skötts på rätt sätt, nästan alla celler uttrycker p75 NTR (för representativ bild se bild. 3a). Orsaken till skillnaden mellan uttrycket av Islet-1 / 2 och p75 NTR är antagligen eftersom ländryggen motoneurons differentiellt uttryck för högre och lägre nivåer av Islet-1 / 2 10. Vid låga nivåer av Islet-1 / 2 uttryck detta kan ha undgått vår uppmärksamhet i immuncytochemical färgning och efterföljande räknas som vi var stränga med hänsyn till positiva kontra negativa celler (tab. 1). Dessutom visar tabell 1 tydligt att de isolerade cellerna överlever förfarandet i en hälsosam kondition, eftersom det bara finns några få trypan-blå positiva celler som tyder på att cellerna oåterkalleligt skadas. Detta alterative förfarande gör det också möjligt isolering av motoneurons från enstaka embryon och därför blandade genotyp kullar från embryonala möss. Sammanfattningsvis har detta alternativ till panoreringen förfarande med p75 NTR antikroppen 6 liknande om inte identisk kapacitet i form av eventuell tillämpning varierar och ger ett billigt och effektivt alternativ reningsmetod för mus embryonala motoneurons.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Sandra Bargen för utmärkt teknisk support. Detta arbete stöddes av Protein forskningsavdelning (PRD, TP A1.2 (RC och TS) och RUB forskning Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Den monoklonala antikroppar 39.4D5 och F55A10 erhölls från utvecklingsstudier Hybridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
