Summary
Una forma alternativa de aislar a las neuronas motoras de embriones de ratón de la médula espinal se describe. El método tiene en cuenta el hecho de que las lectinas pueden unirse a los nervios de baja afinidad p75NTR receptor del factor de crecimiento. Esta lectina preplating basado permite una purificación similar a la que con un anticuerpo específico contra el p75NTR.
Abstract
Motoneuronas espinales evolucionar hacia estadios postmitóticas hasta principios de desarrollo embrionario del sistema nervioso y, posteriormente, crecen las dendritas y los axones. Células neuroepiteliales del tubo neural que expresan Nkx6.1 son las únicas células precursoras de las neuronas motoras espinales 1. A pesar de las motoneuronas postmitóticas avanzar hacia su posición final y se organizan en columnas a lo largo del tracto espinal 2,3. Más del 90% de todas estas motoneuronas diferenciado y posicionado expresar los factores de transcripción Islet 1 / 2. Que inervan los músculos de las extremidades, así como las del cuerpo y los órganos internos. Entre otras, las neuronas motoras suelen expresar los receptores de alta afinidad para el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y la neurotrofina 3 (NT-3), la tropomiosina relacionadas quinasa B y C (TrkB, TrkC). Ellos no expresan la quinasa tropomiosina relacionados A 4 (TrkA). Junto a los dos receptores de alta afinidad, las motoneuronas no expresan la baja afinidad por los receptores de neurotrofinas p75 NTR. El p75 NTR puede unir a todos neurotrofinas con afinidad similar, pero menor a todas las neurotrofinas que los receptores de alta afinidad que se unen las neurotrofinas maduras. Dentro de la médula espinal embrionaria, la p75 NTR se expresan exclusivamente en las neuronas motoras espinales 5. Esto ha sido utilizado para desarrollar técnicas de aislamiento de las motoneuronas para purificar las células de la gran mayoría de las células que rodean 6. Motoneuronas aislar con la ayuda de anticuerpos específicos (panning) en contra de los dominios extracelulares de p75 NTR ha resultado ser un método costoso como la cantidad de anticuerpo utilizado para un solo experimento es alta debido al tamaño de la placa utilizada para el desplazamiento lateral. Una alternativa mucho más económica es el uso de lectinas. Lectina se ha demostrado que se unen específicamente a p75 NTR y 7. El método siguiente describe una técnica alternativa utilizando aglutinina de germen de trigo por un procedimiento preplating en lugar de los anticuerpos p75 NTR. La lectina es una alternativa muy económica para el anticuerpo p75 NTR y los grados de purificación utilizando lectina es comparable a la de los anticuerpos p75 NTR. Motoneuronas de la médula espinal de embriones puede ser aislado por este método, sobrevivir y crecer neuritas.
Protocol
Para los reactivos especiales: ver Tab. 1. Todos los demás reactivos se enumeran en la calidad del grado de cultivo de células obtenidas de Sigma Aldrich.
1. PORN-H/laminin recubrimiento de platos / cubreobjetos
- Prepare una solución de trabajo de 0,5 mg / ml de poli-DL-ornitina bromhidrato (PORN-H) en 150 mM pH de borato 8,35.
- Una solución stock de 50 mg PORN / 1 ml de tampón borato se pueden preparar con antelación y almacenadas a -20 ° C.
- Esterilizar cubreobjetos de vidrio de fuego en el 100% de etanol y dejar secar al aire.
- Cubrir la superficie con suficiente PORN-H solución de la noche a 4 ° C.
- Al día siguiente, lavar tres veces con agua esterilizada y cubreobjetos se seque al aire.
- Prepare una solución de trabajo de 2,5 mg / ml laminina en HBSS
- Alícuotas pueden ser almacenadas a -20 ° C. Descongelar a 4 º C inmediatamente antes de su uso.
- Cubra la superficie de los cubreobjetos PORN-H-cubierto con la solución de laminina y dejar que ellos se incuba durante al menos 2 horas a temperatura ambiente hasta su uso.
2. Recubrimiento de lectina de la purificación de placas
- Prepare una solución de 10 mM Tris en agua esterilizada, pH 9,5.
- Añadir lectina (resolver la lectina (Sigma L9640) en polvo en HBSS) a una concentración final de 10 mg / ml.
- Cubrir la superficie de una placa de cultivo celular de 10 cm con 8 ml de la solución de lectina y se deja incubar durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar la placa tres veces con HBSS y almacenar en HBSS hasta su uso.
- Prepare un 30 mM KCl, 0,8% (w / v) NaCl despolarización solución. Esterilice por filtración y almacenar a temperatura ambiente (TA).
3. Motoneurona medio de cultivo
- Descongelar el suero de caballos durante la noche a 4 ° C e inactivar a 55 ° C durante 30 minutos, en alícuotas de 5 ml y almacenar a -20 ° C. Alícuota descongelar directamente antes de su uso a temperatura ambiente.
- Tienda B27-suplemento en un aliqouts ml a -20 ° C. Descongelar a temperatura ambiente B27 suplemento inmediatamente antes del uso. Evitar ciclos de congelación y descongelación.
- Glutamax alícuota en alícuotas de 0,5 ml y almacenar a -20 ° C y uso en 1:100.
- Prepare una solución stock de 10 mg / ml CNTF en agua esterilizada con 0.1% de BSA. Almacenar a -20 ° C.
- Mezcla de 46 ml de medio neurobasal con 2,5 ml de suero de caballos, 1 ml B27-complemento y 0,5 ml glutamax directamente antes de su uso.
- Añadir CNTF a una concentración final de 10 ng / ml de medio y medio de pre-calentamiento a 37 º C.
4. La disección de la médula espinal
- Sacrificar un ratón E12.5 embarazada y la toma de embriones con cuidado. Añade suficiente HBSS RT para cubrir completamente los embriones.
- Quitar la cabeza y la cola y el lugar de la parte posterior del embrión con los miembros a horcajadas.
- Fijar el embrión con un fórceps y quitar la piel exterior con las pinzas de otros.
- Eliminar la médula espinal por la perforación de las pinzas bajo, y la levante con ver como los movimientos en ambos lados de la médula espinal.
- La transferencia de la médula espinal aislada de un nuevo plato con HBSS y abrir el canal central de la médula espinal en la parte dorsal.
- Quitar los ganglios de la raíz dorsal mediante la eliminación de las meninges envolvente de la médula espinal.
- Reúne las piezas lumbar de la médula espinal de un máximo de 6 embriones por placa de lectina en un tubo eppendorf reacción llena de un HBSS ml y almacenar en hielo hasta que la preparación se lleva a cabo.
5. Enriquecimiento de las motoneuronas por lectina basado en la purificación
Nota: Antes de comenzar los pasos a seguir, la última que le preparan y precalentar el medio (ver paso 3).
- Prepare una solución de tripsina por la solución de 1 g de tripsina en 100 ml HBSS, almacenar a -20 ° C y descongelar a 4 ° C.
- Mezclar 1 g de tripsina inhibidor con 98 ml de HBSS y 2 ml de 1 M pH 7,4 HEPES, alícuotas de 1 ml deben ser almacenados a 4 ° C.
- Transferir el tubo con la médula espinal a una campana de cultivo de células y retirar con cuidado 700 l de la HBSS.
- Añadir 7,5 l de solución de tripsina y mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo.
- Realizar tripsinización durante 8 minutos a 37 ° C.
- Detener la reacción añadiendo 30 l inhibidor de la tripsina y la pipeta hacia arriba y hacia abajo (triturar) cuidadosamente 10-15 veces con una pipeta 1.000 l hasta que no haya más agregados de células son visibles. Repita la trituración con una pipeta de 20 a 200 l, y la punta correspondiente.
- Pipeta la solución de células en la placa de lectina HBSS y lleno de dispersar las células suavemente girando el plato.
- Guarde la placa de la lectina de 60 min a temperatura ambiente sobre una superficie libre de vibraciones. Cúbralo para evitar la contaminación.
- Retire la HBSS muy suavemente y se lava la placa con cuidado 4 veces con pre-calentado HBSS para eliminar fragmentos de células y las células no se adjunta / solteras.
- Inmediatamente después de la última etapa de lavado, añadir 500 l solución de la despolarización de la placa y se deja incubar durante 1 minuto.
- Facilitar el desprendimiento de las células de la lectina obligado por agitación ytocando la placa.
- Llenar el plato con 2 ml de medio de la cultura pre-calentado y transferir a un tubo Falcon de 15 ml.
- Contar el número de células con una cámara de recuento Neubauer.
- Placa de la celda de la laminina cubreobjetos recubiertos o placas en un número adecuado dependiendo de la aplicación.
- Realizar un intercambio de soportes en el día 1 y, posteriormente, cada dos días por el reemplazo cuidadoso de un 50% de la mediana edad. Utilice siempre pre-calentado, medio recién preparado una nueva cultura.
6. Los resultados representativos:
Motoneuronas embrionarias se pueden obtener de embriones de ratón en el E12 a E14. 2.3% de la población total de células de la médula espinal lumbar consiste en neuronas motoras y, como las neuronas ganglionares raíz dorsal se p75 NTR-positivas, así, es importante para deshacerse de estas células antes de iniciar el procedimiento preplating lectina basado en ( Para información general véase la Figura 1 y Figura 2). En segundo lugar, las meninges son las células con fuerza divisoria que debe ser excluido, así, ya que no pueden ser eliminados correctamente por el procedimiento basado en preplating lectina (Figura 2 y Figura 3). En el peor de los casos, estas células pueden crecer demasiado las placas de cultivo. Las imágenes de representación en la figura 3B y 3D también dar una impresión acerca de la densidad celular más baja después de los procedimientos de lavado se han realizado (véase el paso 5.9 del protocolo). Los cultivos de motoneuronas embrionarias de ratón son por lo general se mantiene hasta para cinco o siete días. Durante este período de tiempo las células establecer sus axones hasta una longitud máxima (Figura 4). Longitudes de las neuritas, dependen fuertemente del sustrato en el 8 placas. El sustrato típico es la laminina, que se aplica sobre PORN-H placas de cultivo cubierto. Motoneuronas también puede crecer en otros sustratos o menos definidas, como las matrices extracelulares generados por la lisis del agua 8. En los casos de recubrimiento óptimo de longitud, las neuritas y el área del cono de crecimiento se redujo y la muerte celular por lo general aumenta. Soporte trófico juega un papel crucial para la supervivencia de las motoneuronas de embriones de ratón en cultivo. Supervivencia de las células inicialmente plateado en el día siete caída de 10% a 20% sin el apoyo trófico 6. Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF) son los factores más comúnmente utilizado, pero otros pueden promover la supervivencia, así [el factor inhibidor de leucemia (LIF), cardiotrofina-1 (CT-1), factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF ), similar a la insulina factor de crecimiento 1 (IGF-1) 9].
Figura 1. Flujo esquema para la preparación de las neuronas motoras de embriones de ratón. El esquema ilustra los diferentes pasos para el aislamiento y la cultura de las neuronas motoras de embriones de ratón. Abreviaturas: SC: la médula espinal; HBSS: solución salina equilibrada de Hanks, MN: motoneurona.
Figura 2 El aislamiento de la parte lumbar de la médula espinal de ratón E12.5 A:.. E12.5 embrión de ratón. Para el siguiente paso, la cabeza y la cola se eliminan y el cuerpo es colocado en una posición dorsal B-up: Embrión en posición dorsal-up. Pinzas en la parte izquierda y derecha de la médula espinal son la fijación del cuerpo del embrión en su posición. Uno de los fórceps se utilizan posteriormente para cortar la piel y cortar debajo de la médula espinal de la otra se utiliza para fijar el embrión en su posición C:. Médula espinal aisladas de embriones de ratón E12.5. Las partes de la médula espinal (cervical, dorsal, lumbar) se indican. La médula espinal está rodeada por las meninges y parte de los ganglios de la raíz dorsal todavía se adhieren a ellas D:. La médula espinal es cortada longitudinalmente en la parte dorsal para abrirla hacia el canal central E:. Las meninges en la cara ventral están tomadas de la médula espinal aplanado. Nota: Aunque retirado, la región lumbar se caracteriza por un pequeño corte. F: Sólo la parte lumbar de la médula espinal es llevado por otros procedimientos.
Figura 3 Determinación y aislamiento de islotes de células positivas a partir de la médula espinal lumbar de E12.5 embriones de ratón A:.. Las etiquetas Islet-1 / 2 de anticuerpos columnas de las motoneuronas en la médula espinal lumbar embrionarias (rojo, flecha) y las etiquetas de todos los Hoechst núcleos dentro de la sección. Sección transversal de un cable de E12.5 lumar espinal. E12.5 embriones de ratón se fija inmersión en paraformaldehído al 4% durante 6 h, se lavaron 3 veces con tampón fosfato salino y tratados con sacarosa de acuerdo con los procedimientos estándar. Cryosections de 20 micras fueron tomadas con un criostato y las secciones se manejan para la tinción immunhistochemical de acuerdo con los procedimientos estándar de 11. El software posteriormente las secciones marcadas con Hoechst para la localización de los núcleos celulares. Tenga en cuenta quelas neuronas ganglionares raíz dorsal se Islet-1/2-positive así y que el procedimiento de preparación no incluye esta parte de tejido del procedimiento de aislamiento B:. Islet-1 / 2 etiqueta (rojo, flecha) disociar las células de la médula espinal lumbar de E12. 5 embriones, a la izquierda - y antes de la derecha - después de lectina basado preplating. Las células fueron contrastados con Hoechst para visualizar todos los núcleos de las células C:. Cuantificación de células Islet-1/2-positive antes y después de lectina basado preplating D:. Nkx6.1 motoneuronas etiqueta de E12.5 embriones después de un día en la cultura. Las células fueron contrastados con Hoechst para cisualieze todos los núcleos. Tenga en cuenta que el 90% de todas las células son Nkx6.1 positivo. Abreviaturas: SC: la médula espinal, MN: motoneurona; DRG: ganglio de la raíz dorsal.
Figura 4 Caracterización de las motoneuronas E12.5 ratón A y B:.. Enriquecido aislados E12.5 ratón lumbar motoneuronas espinales expresar p75 NTR a 0 días in vitro (0div) y el día 2 in vitro (2DIV). Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y posteriormente teñidos para p75 NTR acuerdo con los procedimientos estándar. Las células fueron counterstained con Hoechst para visualizar todos los núcleos de C:. Motoneuronas enriquecido después de 5 días in vitro (5div) en el PORN y la laminina-H como sustratos de cultivo y en la presencia de manchas CNTF de β-III-tubulina. Tenga en cuenta que las células han desarrollado a partir neuritas largas y mostrar la morfología típica de las motoneuronas con un tiempo (ramas) del proceso y uno o más procesos más cortos (axones y dendritas). Abreviaturas: MN: motoneurona, div: días in vitro.
| Después de la disociación, sin lectina basado preplating | |||
| Número total de células / SC | El azul tripán de células positivas [%] | Islet-1/2- células positivas [%] | |
| 1 | 995.0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889.4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| Media ± DE | 1.021.0 ± 147,1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| Con lectina basado preplating | |||
| Número de células después de preplating / SC | El azul tripán de células positivas [%] | Islet-1/2- células positivas [%] | |
| 1 | 189.6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168.8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125.0 | 0,0 | 72,5 |
| Media ± DE | 161,1 ± 33,0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
Tabla 1. Resumen de resultados de los procedimientos de aislamiento representante de las neuronas motoras de embriones de ratón de la etapa E12.5. A partir de 3 diferentes procedimientos de aislamiento especialmente para este fin se dan como el número total de números o porcentaje ± SD. Abreviatura: SC: la médula espinal; SD: desviación estándar.
| Islet-1 / 2 células positivas a p75 paneo [%] | Islet-1 / 2 células positivas con lectina basado paneo [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
Tabla 2. Resultados de la comparación de la lectina base y p75 basada en un encuadre números de las motoneuronas de la célula. Se dan los números de porcentaje ± SD.
Discussion
La ventaja de esta técnica basada en preplating lectina es que es menos costoso que el p75 NTR un procedimiento basado en paneo, y la lectina es más estable que los anticuerpos. El enriquecimiento que figuran en la figura. 2 y Tab. 1 muestra que el procedimiento permite a la purificación de un número similar de células y que la mayoría de estas células expresan el marcador de las motoneuronas Islet-1 / 2. El paso más crítico es el procedimiento de aislamiento de la médula espinal lumbar. La eliminación de las meninges y el GRD (Fig. 2) es esencial para el procedimiento de purificación después de lectina basado preplating. Si esto ha sido manejado correctamente, casi todas las células expresan el p75 NTR (para la imagen representativa ver fig. 3a). La razón de la diferencia entre la expresión de Islet-1 / 2 y p75 NTR es muy probablemente debido a las motoneuronas lumbar expresan diferencialmente los niveles superior e inferior de Islet-1 / 2 10. En el caso de los bajos niveles de Islet-1 / 2 esta expresión podría haber escapado a nuestra atención en la tinción immuncytochemical y contando posteriores a medida que eran estrictos con respecto a las células positivas frente a los negativos (Tabla 1). Además, el cuadro 1 muestra claramente que las células aisladas sobreviven al procedimiento en una condición saludable, ya que sólo hay unos pocos tripán azul células positivas que indican que las células son irreversiblemente dañados. Este procedimiento alterativo también permite el aislamiento de las neuronas motoras a partir de embriones individuales y por lo tanto, de camadas mixtas genotipo de ratones embrionarios. En conclusión, esta alternativa al procedimiento de la panorámica con el anticuerpo p75 NTR 6 tiene similares si no idénticas capacidades en términos de rangos de posible aplicación y proporciona un método alternativo de purificación barato y eficiente para las motoneuronas embrionarias de ratón.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a Sandra Bargen para el apoyo técnico excelente. Este trabajo fue apoyado por el departamento de investigación de proteínas (PRD, PT A1.2 (RC y TS), y la investigación RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK), los anticuerpos monoclonales y 39.4D5 F55A10 se obtuvieron a partir del hibridoma Estudios del Desarrollo Bank (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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