Summary
In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.
Abstract
De placenta is verantwoordelijk voor het transport van voedingsstoffen, gassen en groeifactoren voor de foetus, alsmede de verwijdering van afvalstoffen. Zo defecten in ontwikkeling van de placenta belangrijke gevolgen voor de foetus en moeder en zijn een belangrijke oorzaak van embryonale letaliteit. De belangrijkste celtype van de foetale deel van de placenta de trofoblast. Primaire muis placenta trofoblastcellen een nuttig hulpmiddel om normale en abnormale ontwikkeling van de placenta, en in tegenstelling cellijnen kunnen worden geïsoleerd en gebruikt om trofoblast studeren in specifieke stadia van de zwangerschap. Daarnaast kunnen primaire kweken van trofoblast uit transgene muizen worden gebruikt om de rol van bepaalde genen in cellen van de placenta te bestuderen. De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de beschrijving door Thordarson et al.. 1, waarbij een Percoll-gradiënt wordt gebruikt om een relatief zuivere trofoblast celpopulatie verkrijgen van geïsoleerde muis placenta. Het is vergelijkbaar met de meer algemeend methoden voor menselijke trofoblast celisolatie 2-3. Zuiverheid kan worden bepaald door immunocytochemisch kleuren van de geïsoleerde cellen voor cytokeratine 7 4. Hier worden de geïsoleerde cellen geanalyseerd met een matrigel invasie assay te beoordelen trofoblast invasiviteit in vitro 5-6. De binnengedrongen cellen geanalyseerd door immunocytochemie en gekleurd voor tellen.
Protocol
1. Dissectie van de muis placenta
- Stel paring paren van muizen.
- Op elk van de volgende dagen, te controleren op de aanwezigheid van een copulatory stekker. De dag waarin een plug wordt gedetecteerd wordt beschouwd als 0,5 dagen na de coïtus (dpc) 7.
- Placenta kunnen worden verzameld bij de gewenste fase van de zwangerschap met een schone ontleding van de placenta mogelijk begin met de ontwikkeling van de placenta van rijpe d 10.5. Hier laten we zien 14,5 dpc. Bij de opgegeven volumes is 40-60 placenta op 10,5 dpc, en 10-20 placenta op 14,5 dpc leveren een duidelijk zichtbare trofoblast cellaag.
- Euthanaseren de zwangere muis, en verwijder de baarmoeder, het snijden in de baarmoederhals, en langs de mesometrium.
- Met behulp van een scherpe schaar, knip tussen elke conceptie (Figuur 1A).
- Gebruik van twee paar tang, pakt u de baarmoederwand aan de snijkant en trek uit elkaar, het verwijderen van het myometrium (Figuur 1B) . Een paar gekartelde, matig fijn (gebogen of rechte) tang plus een paar zeer fijne tang (# 5, bijvoorbeeld) wordt aanbevolen.
- Tegenover de placenta, opent u de decidua met een tang of schaar, het blootstellen van placenta. Baarmoederweefsel grijpen met een paar pincetten, schuift een forceps onder de placenta te scheiden (figuur 1C). Eventueel aparte foetus en foetale membranen van placenta. Het is niet mogelijk om alle deciduale weefsel dissectie verwijderen zonder verlies ook placentaweefsel, maar extra deciduale weefsel (licht) worden verwijderd van het oppervlak van de placenta voorzichtig peeling met forceps. Wij vertrouwen op de Percoll-gradiënt voor verdere zuivering.
- Plaats elke placenta ontleed in 25 ml ijskoude buffer dissociatie in een 50 ml conische buis totdat alle secties zijn voltooid. In een later stadium, grof placenta weefsel voorafgaand gehakt met een schaar of scheermesje om te zetten in dissociatie buffer.
- Losjes cap conische buis en plaats in een 37 ° C bad voor 45-60 minuten. Meng krachtig de dissociatie oplossing pipetteren ongeveer elke 10 minuten. De totale destructietijd moeten nauwgezet worden gevolgd en zal waarschijnlijk vereist wat trial and error om een optimale cel herstel te bereiken. Weefsels moeten kunnen worden door een 10 ml pipet, maar zichtbare stukjes weefsel blijft. Overdigestion zal slechte celoverleving en plating efficiency. Optimale celoverleving en plating efficiency zal gebeuren wanneer groepjes van enkele cellen aanwezig zijn, dan wanneer volledige dissociatie wordt bereikt. Omgekeerd zal underdigestion leiden tot minder zuiverheid na Percoll scheiding. Wanneer de goede vertering bereikt is, plaats buis op ijs stoppen collagenase activiteit.
- Laat de oplossing door een celzeef te onverteerd materialen te verwijderen, en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten.
- Te wassen, te verwijderensupernatant en resuspendeer cellen in 10 ml wasoplossing. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten.
- Tijdens het centrifugeren, bereid door het mengen Percoll oplossing 9,6 ml Percoll, 13,4 ml wasoplossing en 1,1 ml 10x medium 199 in een 50 ml buis geschikt voor hoge snelheid te centrifugeren.
- Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 2 ml wasoplossing.
- Toevoegen cellen oplossing Percoll en @ 30.000 xg gecentrifugeerd gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder de buis uit centrifuge zonder verstoring van het verloop. Om de gradiënt, plaats buis te visualiseren in de voorkant van een heldere lichtbron. Zoek de trofoblast band (figuur 2), en zuigen met een pipet, zorg ervoor dat u de rode bloedcel band onder verstoren. Volume van de trofoblast band zal 5 tot 8 ml.
- Overdracht trofoblastcellen een 50 ml conische buis. Toevoegen wasoplossing tot een totaal volume van 45 ml.
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer in cultuur medium (NCTC-135). Cellen kunnen worden gekweekt op dunnelaag matrigel of weefselkweek plastic bij 37 ° C en 5% CO2. Op dag 10,5, elke placenta levert ongeveer 50.000 levende cellen, waarvan 80-90% wordt cytokeratine positief.
3. Trofoblastinvasie Assay
- Voeg 1-2 ml kweekmedium (NCTC-135) elk matrigel kamer en incubeer bij 37 °, 5% CO2 gedurende 30-90 min.
- Verwijder medium, en voeg 1,5 ml x 10 5 vers geïsoleerde cellen in 2 ml medium tot bovenste kamer. Voeg 1 ml medium aan onderste compartiment naar lagere membraanoppervlak bedekken.
- Kweekcellen in inserts 18-24 uur.
- Schraap cellen en Matrigel van het inzetstuk met behulp van een schuim wattenstaafje.
- Spoel de top en bodem van de kamer in 2 ml PBS.
- Oplossing voor 5 min in 1 ml 4% paraformaldehyde in PBS.
- Vlek vult onderste kamer met 400 ui DAPI (300 nM) en incubeer gedurende 30 minuten.
- Spoel even driemaal in PBS.
- Voeg 10 ul druppel fixeermiddel (50% glycerol in PBS) te glijden. Met behulp van een tang, leg membraan op drop. Voeg een 10 ul druppel medium, dan voorzichtig dekglaasje aan.
- Foto en tellen cellen. Zorg ervoor dat u te oriënteren het membraan op de juiste wijze (cel naar boven of cel-kant naar beneden) voor de microscoop wordt gebruikt. Afbeelding J software (National Institutes of Health) een handmatige telling functie die kan worden gebruikt voor dit doel, evenals Adobe Photoshop of een handmatige teller.
4. Representatieve resultaten
Figuur 1. Dissectie van de muis placenta. (A) De baarmoeder verwijderd door snijden langs de eileiders (geel), langs het mesometrial oppervlak en de baarmoederhals (onder). Individuele conceptuses kan dan worden gescheiden door snijden met een schaar zijn. (B) De baarmoeder wand wordt verwijderd door twee forceps in de baarmoeder gesneden oppervlak en scheuren langs de anti-mesometrial kant bij de foetus en weg van de placenta. (C) De placenta wordt vervolgens geïsoleerd door grijpen met een forceps en glijden andere tussen de placenta en baarmoederweefsel. Navelstreng en andere extra-embryonale membranen kunnen dan gescheiden van de placenta.
Figuur 2. Percoll scheiding van trofoblastcellen. Na centrifugeren wordt drie banden zichtbaar zoals in cartoon links ziet, foto rechts. De bovenste band bevat celresten en fibroblasten en het meest duidelijk. A tight (rood) band aan de onderkant met rode bloedcellen zichtbaar net onder de trofoblast diffuse band. Celaggregaten zal waarschijnlijk gezien in de trofoblast band, zoals in de twee getoonde net links van de pijl in de foto.
Figuur 3. Invasieve trofoblast cellen (witte pijl) gaat door de Matrigel laag en het membraan poriën, die op het onderste oppervlak van het membraan. De poriën zijn ook zichtbaar (zwarte pijl). Het aantal cellen op het gehele membraanoppervlak of een representatief gebied kan worden geteld. Een afbeelding met grijswaarden van TL-DAPI nucleaire kleuring is omgekeerd om visualisatie van cellen te verbeteren.
Figuur 4. Trofoblastcellen kunnen worden geïdentificeerd en de zuiverheid van de geïsoleerde populatie geëvalueerd door immuunkleuring voor cytokeratine 7 (midden, magenta). Cellen worden tegengekleurd met DAPI (boven, blauw). Samengevoegde afbeelding, onderaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video tonen we de isolatie van trofoblastcellen van de muis placenta. Vervolgens tonen een in vitro assay voor trofoblastinvasie. Met deze procedure een grotendeels, maar niet geheel, kan zuivere populatie trofoblastcellen worden verkregen. Als verdere zuiverheid vereist is, kan magnetische bead scheiding of flowcytometrie worden uitgevoerd, zoals is beschreven voor primaire humane trofoblastcellen. De juiste lengte van de collagenase dissociatiestap moet worden bepaald bij elk experiment en worden geleerd door ervaring. Over-vergisting zal sterk verminderen cel herstel, terwijl onder-vergisting kan leiden tot gereduceerde zuiverheid, alsmede lagere nummers. Hoewel we tonen het gebruik van commercieel bereide Matrigel invasie kamers, kunnen zij ook worden bereid door matrigel mate onbeklede transwell kamers op de gewenste dikte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de Creative Services team bedanken van de Universiteit van Missouri Academic Support Center, die geproduceerd deze video. Dit werk werd ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development van de National Institutes of Health, licentienummer HD055231
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
