Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Summary

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Abstract

Plasenta fetusun besin, gazlar ve büyüme faktörlerinin taşıma yanı sıra, atıkların ortadan kaldırılması için sorumludur. Böylece, plasental gelişim kusurları, anne ve fetus için önemli sonuçları vardır ve embriyonik ölümcül önemli bir nedenidir. Plasenta fetal kısmının başlıca bir hücre türüdürler trofoblast olup. Birincil fare plasental trofoblast hücreleri normal ve anormal plasental geliştirme çalışmaları için yararlı bir araçtır, ve hücre çizgileri, farklı olarak, izole edilmiş ve hamilelik belirli aşamalarında trofoblast incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, transgenik fareler trofoblast primer kültürlerden plasental hücreleri içinde belirli genlerin rolü incelemek için kullanılabilir. Burada sunulan protokol Thordarson ve arkadaşları tarafından açıklama esas alınmaktadır. Bir Percoll gradient izole edilmiş fare plasentası gelen, saf bir trofoblast hücre popülasyonu elde etmek için kullanıldığı, ^1,. Bu, daha yaygın olarak kullanmak için benzerİnsan trofoblast hücre izolasyonu ^2-3 d yöntemleri. Saflık sitokeratin 7 ⁴ için izole hücrelerin immünohistokimyasal boyama ile değerlendirilebilir. Burada, izole hücreler daha sonra in vitro ^5-6 trofoblast invazivlik değerlendirmek için bir Matrigel işgali testi kullanılarak analiz edilmiştir. Işgal hücrelerin sayımı için immünsitokimya ve lekeli tarafından analiz edilir.

Protocol

1. Fare plasentanın Diseksiyon

1. Farelerde çiftleşme çiftleri ayarlayın.
2. İlerleyen günlerde her birinde, bir çiftleşme fiş varlığını kontrol edin. Bir fiş tespit edildiği gün 0.5 gün sonrası cinsel birleşme (DPC), ^7. olarak kabul edilir.
3. Plasentası d 10.5 olgun plasentanın gelişimi ile plasenta mümkün başında temiz bir diseksiyon ile, gebeliğin istenen aşamada toplanabilir. Burada, 14.5 DPC göstermektedir. Verilen miktarlar ise, 10.5 DPC üzerine 40-60 plasenta ve 14.5 DPC 10-20 plasentası açıkça görülebilen bir trofoblast hücre tabakası verecektir.
4. Hamile fare Euthanize ve servikste kesme, rahim kaldırmak ve mesometrium boyunca.
5. Her konseptus (Şekil 1A) arasında kesilmiş keskin bir makas, kullanma.
6. Forseps, iki çift kullanarak, kesme kenarında rahim duvarına kavramak ve uzaklaşmayı, myometrium (Şekil 1B) kaldırma . Bir çift tırtıklı, (kavisli veya düz) orta ince forseps artı bir çift çok ince forseps (# 5, örneğin) tavsiye edilir.
7. Plasenta karşısında, plasenta teşhir, forseps veya makas ile desidua açın. Tek bir forseps bir çift ile uterus dokusu kavra, ayırmak için plasenta (Şekil 1C) altında başka bir forseps kaydırın. Eğer plasenta gerekli, ayrı fetüs ve fetal membranlar. Ayrıca plasental doku kaybetmeden diseksiyonu bütün desidual doku kaldırmak mümkün değildir, ancak ek desidual doku (soluk) yavaşça forseps ile soyulması ile plasenta yüzeyinden uzaklaştırılabilir. Biz daha fazla arıtma Percoll degrade üzerinde de durulacaktır.
8. Her diseksiyonlar bitene kadar 50 ml konik bir tüp içinde 25 ml buz gibi soğuk tampon içinde her bir ayrılma parçalara plasenta yerleştirin. Daha sonraki aşamalarda, iri ayrışma tampon içine aktarmak için önce makas veya jilet ile plasental doku kıyma.

trofoblast hücrelerin alışını "> 2. İzolasyonu

1. 45-60 dakika için bir 37 ° C banyo içinde gevşek bir şekilde kapak konik boru ve bir yer. Yaklaşık her 10 dk pipetleme tarafından şiddetle ayrışma çözüm karıştırın. Toplam sindirim süresi yakından izlenmeli ve muhtemelen bazı deneme yanılma optimum hücre iyileşme elde etmek isteyecektir. Dokular 10 ml pipet geçirilecek gerekir, ancak doku görünür parçaları kalır. Overdigestion zayıf hücre hayatta kalma ve kaplama verimi ile sonuçlanır. Birkaç hücre kümeleri mevcut olduğunda Optimal hücre sağkalım ve kaplama verimliliği yerine tam ayrışma elde edildiğinde daha ortaya çıkacaktır. Tersine, underdigestion Percoll ayrışmadan sonra azalır saflığı yol açacaktır. Uygun sindirim noktasına ulaşıldığında, buz üzerinde yer tüp kollajenaz aktivitesini durdurmak için.
2. Sindirilmemiş malzemeleri çıkarın ve 5 dakika boyunca @ 500 xg'de santrifüj bir hücre süzgecinden çözümü geçirin.
3. Yıkamak için kaldırmak10 ml yıkama çözeltisi içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant hücreler. 5 dakika @ 500 xg santrifüjleyin.
4. Santrifüj sırasında, 9.6 ml Percoll, 13.4 ml yıkama çözeltisi ve yüksek hızlı santrifüjleme için uygun olan bir 50 ml tüp içinde 1.1 ml ortam 10x 199 karıştırılarak Percoll solüsyon hazırlanır.
5. 2 mL yıkama solüsyonu içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın.
6. Çözelti Percoll ve 4 de 30 dakika @ 30,000 x g'da santrifüj ile hücreler ekleme ° C.
7. Degrade bozmadan santrifüj tüpü çıkarın. Parlak bir ışık kaynağının önünde degrade, yerde tüp görselleştirmek için. Trofoblast bant (Şekil 2) bulun ve aşağıdaki kırmızı kan hücresi bant rahatsız etmemek için özen bir pipet yardımıyla aspire. Trofoblast bant hacmi 5-8 ml olacaktır.
8. 50 ml'lik bir konik tüpe trofoblastların aktarın. 45ml toplam hacme yıkama çözeltisi ekleme.
9. 5 dakika @ 500 xg santrifüjleyin. Süpernatantı ve kültür medi tekrar süspansiyonum (NCTC-135). Hücreler 37 ° C'de ve% 5 _CO2 de ince tabaka Matrigel ya da plastik doku kültürü üzerinde kültive edilebilir. Günlük 10.5, her plasenta% 80-90 pozitif sitokeratin hangi kabaca 50.000 canlı hücreleri üretir.

3. Trofoblast invazyonu Assay

1. 37 her Matrigel odası ve inkübe için 1-2 ml kültür ortamı (NCTC-135) ekle °, 30-90 dakika süreyle% 5 CO _2.
2. Orta çıkarın ve üst odacığı 2ml orta 1,5 ml x 10 ⁵ taze izole hücreleri ekleyin. Alt membran yüzeyini kapsayacak şekilde alt kanadı 1 ml orta ekleyin.
3. 18-24 saat için ekler kültür hücreleri.
4. Bir köpük çubukla ovülden Pençe hücreleri ve Matrigel.
5. 2 ml PBS içinde üst ve alt bölme çalkalayın.
6. PBS içinde 1 ml% 4 paraformaldehit içinde 5 dakika için düzeltildi.
7. 400 ul DAPI (300m) ile alt kanadı doldurarak Leke ve 30 dakika inkübe edilir.
8. PBS içinde kısaca üç kez yıkayın.
9. Kaydırmak için montaj ortam maddesi (PBS,% 50 gliserol) ve bir damla 10 ul ekle. Forseps kullanarak, damla membran yatıyordu. Orta bir 10 ul damla ekleyin, sonra dikkatlice lamel.
10. Fotoğraf ve sayım hücreler. Kullanılan mikroskop için uygun şark membran (aşağı cep tarafını yukarı veya hücre tarafı) emin olun. Image J yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri) bu amaç için kullanılabilecek bir el sayma özelliği içerir, can Adobe Photoshop veya manuel sayaç.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Fare plasentanın Diseksiyon. (A) rahim mesometrial yüzeyi boyunca, (sarı) yumurta kanalı boyunca kesilerek çıkarılır ve serviks (alt) olarak alır. Bireysel conceptuses sonra gösterildiği gibi, makas ile kesme ile ayrılabilir. (B) rahim duvar kesme rahim içinde iki yüzey forseps yerleştirerek ve fetus yakın ve uzak plasenta, anti-mesometrial tarafı boyunca yırtarak ile uzaklaştırılır. (C) Plasenta sonra forseps ile açgözlü ve plasenta ve uterus dokusu arasında bir kayma ile izole edilir. Umbilikal kord ve diğer extraembryonic membranlar daha sonra plasenta ayrılabilir.

Trofoblastların Şekil 2. Percoll ayrılması. Santrifüj sonra, üç büyük grup solda karikatür gösterildiği gibi görünür, ve fotoğraf sağda olacak. Üst bant, hücre tortularını ve fibroblastlar içeren ve en çok belirgin olacaktır. Kırmızı kan hücreleri içeren altına yakın Sıkı (kırmızı) bant sadece diffüz trofoblast grup altında gözükecektir. Sadece fotoğraftaki ok sol gösterilen iki gibi Hücre agrega olasılıkla, trofoblast bandında görülen olacaktır.

ove_content ">
Şekil 3,. İstilacı trofoblastların (beyaz ok) zarın alt yüzeyi üzerinde görünen, Matrigel tabaka ve zar gözenekleri geçecek. Gözenekler (siyah ok başı) da görülebilir. Tüm zar yüzey ya da temsili bir numune alanına hücrelerin sayısı sayılır. Floresan DAPI nükleer boyanma bir gri görüntü hücrelerin görsel geliştirmek için ters edilmiştir.

Şekil 4,. Trofoblast hücreleri tespit ve izole nüfusun saflık sitokeratin 7 (merkez, macenta) ile immüno-, değerlendirilebilir. Hücreler DAPI (üst, mavi) ile zıt edilir. Birleştirilmiş görüntü, alt.

Discussion

Bu video olarak, fare plasenta trofoblast hücrelerin izolasyonu göstermektedir. Biz sonra trofoblast invazyonu için in vitro deney göstermektedir. Bu prosedür kullanıldığında, büyük ölçüde tamamen olmasa da, trofoblast hücre saf nüfus elde edilebilir. Daha fazla saflık gerekli ise primer insan trofoblast hücreleri için tarif edildiği gibi, manyetik boncuk ayırma ya da akış sitometrisi, yapılabilmektedir. Kollajenaz ayrışma adımın doğru uzunluğu her bir deney ile tespit edilmeli ve deneyimi ile öğrenmiş olacaktır. Altında sindirim azaltılmış saflık yanı sıra, azaltılmış sayıda yol açabilir oysa Aşırı sindirim ciddi bir şekilde, hücre iyileşme azalır. Bu ticari olarak hazırlanmış Matrigel istila odaları kullanımını göstermek de, aynı zamanda, istenen kalınlıkta kaplanmamış transwell odalarına Matrigel ilave edilerek hazırlanabilir.