Summary
تلوث استعدادات حقيقية النواة ريبوسوم تنقيته بواسطة الطرق التقليدية التي شاركت في تنقية nucleases البروتياز ويؤثر سلبا على مجرى النهر التحاليل البيوكيميائية والهيكلية. ويتم استخدام أسلوب بسيط وسريع لتنقية الكروماتوغرافي لحل هذه المشكلة باستخدام الخميرة ريبوسوم كنظام النموذج.
Abstract
ريبوسوم حقيقية النواة هي أكثر عطوب بالمقارنة مع نظرائهم eubacterial وarchael ، مما يشكل تحديا كبيرا للباحثين. مزعجا بشكل خاص هو حقيقة أن تحلل الخلايا النشرات عددا كبيرا من البروتياز وnucleases التي يمكن أن تتحلل ريبوسوم. وبالتالي ، فمن المهم لفصل ريبوسوم من هذه الإنزيمات في أسرع وقت ممكن. للأسف ، الطرق التقليدية تنبيذ فائق الفرق ريبوسوم يترك عرضة لهذه الانزيمات لفترات طويلة من الزمن بشكل غير مقبول ، مما يؤثر على سلامتها الهيكلية والوظيفية. لمعالجة هذه المشكلة ، ونحن استخدام أسلوب الكروماتوغرافي باستخدام السيستين اتهم Sulfolink الراتنج. هذا التطبيق بسيطة وسريعة يقلل بشكل ملحوظ شارك في أنشطة تنقية وnucleolytic بروتين ، وتنتج غلة عالية من سليمة ، ريبوسوم الخميرة النشطة كيميائيا للغاية. نقترح أن هذا الأسلوب يجب أن ينطبق أيضا على ريبوسوم الثدييات. بساطةالأسلوب ، والنقاء ، وتعزيز نشاط الريبوسوم المنقى chromatographically يمثل تقدما كبيرا التقنية لدراسة ريبوسوم حقيقية النواة.
Protocol
1. اتهم إعداد السيستين Sulfolink الراتنج
- إعداد Sulfolink الراتنج (بيرس) في درجة حرارة الغرفة.
- مكان ما مجموعه 10 مل من الطين 50 ٪ من هلام Sulfolink اقتران كما تم توفيره من قبل الشركة المصنعة في اثنين من قوارير البلاستيك 10 مل ، مع 5 مل موزعة على كل قنينة.
- الطرد المركزي لفترة وجيزة في قارورة 850 XG وإزالة بعناية supernatants.
- يغسل ثلاث مرات في هلام العازلة اقتران (50 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.5 ، 5 مم EDTA) عن طريق إعادة التعليق على حبات في 5 مل ، الطرد المركزي لفترة وجيزة بمبلغ 850 XG وإزالة طاف بواسطة ماصة.
- إضافة خمسة مل من حل 50 ملم من السيستين - L العازلة في اقتران كل أنبوب ومزج الطين لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية.
- إزالة بقايا L - السيستين عن طريق الغسيل كما هو موضح في الخطوة 1.4 أعلاه.
- Resuspend الجل في 10 مل من العازلة ملزمة [HEPES 20 ملي ، ودرجة الحموضة 7.6 ، 5 مم ميغاغرام (OAC) 2 ، 60 مم NH 4 CL ، 2 مم DTT] ، ويوازن الراتنج عن طريق الغسيل في 10 مل من العازلة ملزم3 مرات كما هو موضح في الخطوة 1.4. صب الراتنج الى 10 مل الطرد المركزي وكأب ، وتخزينها في العمود 4 درجات مئوية. قدرة الراتنج للربط الحمض النووي الريبي هو ~ 20 ألف وحدة لكل 260 مل.
2. اتهم تنقية الكروماتوغرافي من ريبوسوم باستخدام السيستين Sulfolink الراتنج
ملاحظة : إذا كنت تعمل مع سلالة حيث النشاط البروتيني يبرهن على أن تكون قضية ، ويمكن استخدام الزجاجات تثبيط الأنزيم البروتيني في جميع مخازن لاحقة.
- الحفاظ على كل المكونات على الجليد وإعداد جميع الحلول باستخدام ريبونوكلياز خالية من المياه المعقمة والترشيح.
- زراعة خلايا الخميرة وحتى منتصف الليل سجل المرحلة (OD 595 = 0،6-1،2) في وسائل الإعلام المناسبة. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي ، وغسل خلايا غرام 1 في المخزن ملزمة والطرد المركزي في 3700 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- Resuspend الخلايا في 1 مل من العازلة ملزمة لحجم إجمالية تقارب 2 مل ، وتعطيل استخدام حجم مساو من الخرز الزجاجي 0.5 ملم المبردة إلى 4 درجات مئوية شغناء Biospec مصغرة حبة الخافق (Bartlesville ، OK). يمكن تقسيم العينات في أنابيب متعددة حسب الحاجة.
- إزالة الخلايا غير منقطعة ، والعضيات ، والحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي في 30000 x ج لمدة 30 دقيقة في نابذة فائقة السرعة أوبتيما بيكمان كولتر E - ماكس (فولرتون ، كاليفورنيا).
- فورا قبل الاستخدام ، بيليه الراتنج لدقيقة واحدة في 1000 لإزالة XG حل التخزين. يستخدم اثنين مل من راتنج لكل غرام واحد من الخلايا.
- إزالة supernatants lysate الخلية من زيادة ونقصان XG 30000 (S30) ، مع الحرص على تقليل التلوث من أي جزء من المادة الدهنية في أعلى جدا أو حطام خلية في الجزء السفلي من الأنابيب ، ووضع مباشرة في الطين Sulfolink المشحونة. ويمكن تجنب طبقة الدهون إما عن طريق إزالة أو عن طريق دفع خارجا من الماصة بعد تلميح قد عبرت الى طاف.
- احتضان الخليط S30/Sulfolink على الجليد من دون خلط لمدة 15 دقيقة.
- وضع الأعمدة في أنابيب مخروطية 15 مل و الطرد المركزي في 1000 x ج لمدةص دقيقة واحدة.
- مكان الكسور flowthrough مرة أخرى إلى الأعمدة ، مزيج من جهة ، واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى على الجليد.
- وضع الأعمدة في أنابيب مخروطية 15 مل و الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة دقيقة واحدة. تجاهل flowthrough.
- وإضافة أعمدة سقف 5 مل من العازلة ملزمة. مزيج أعمدة باليد حتى معلق ، تنزع الأغطية ، والطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في الأعمدة 1000 x ج لمدة دقيقة واحدة. كرر هذا البروتوكول غسل مرتين أخريين.
- إضافة 1.5 مل من شطف العازلة (20 ملي HEPES - كوه ، ودرجة الحموضة 7.6 و 10 ملي ميغاغرام (OAC) 2 ، 500 ملم بوكل ، 2mm وDTT ، 0.5 ملغ / مل الهيبارين) إلى كل عمود. عجائن مزيج من جهة ، واحتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة
- مكان الأعمدة إلى أنابيب جديدة مل 15 المخروطية والطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة. جمع شطافة. كرر الخطوة شطف مرة أخرى بحيث النهائي حجم العينة مجتمعة ~ 3 مل. يمكن غسلها راتنج تستخدم مع الهيبارين العازلة دون شطف وتليها موازنة مع buffe ملزمص ، وتخزينها في 10 مل من حجم المخزن المؤقت ملزما عند 4 درجة مئوية لإعادة استخدامها لاحقا.
3. بوروميسين العلاج
ملاحظة : أسلوب بديل لإزالة تلوث الأنواع الحمض الريبي النووي النقال هو التحول من السكر الجلوكوز إلى وسائل الإعلام الغنية المنضب لتعزيز جريان الريبوسوم. ومع ذلك ، فإن هذا لا يغير الوضع الأيضي للخلايا الخميرة ، والتي يمكن أن تؤثر على وظيفة الريبوسوم والتركيز.
من أجل تجريد ريبوسوم من الحمض الريبي النووي النقال - الذاتية ببتيديل ، ويتم تنفيذ المعاملة مع بوروميسين.
- تحييد الى 7.5 درجة الحموضة 100 ملي حل بوروميسين بإضافة 1M KOH قطرة قطرة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة إلى تحييد الحل بوروميسين تركيز 1MM ~ النهائي في شطافة.
- إضافة 100 ملي GTP إلى تركيز النهائي من 1 ملم.
- احتضان لمدة 30 دقيقة حتى 30 درجة مئوية.
4. تنقية ريبوسوم بالترسيب من خلال الوسائد الجلسرين
- مكان واحد ملمن وسادة عازلة (HEPES 20 ملي ، ودرجة الحموضة 7.6 و 10 ملي ميغاغرام (OAC) 2 ، 500 ملم بوكل ، 2 مم DTT ، الجلسرين 25 ٪) في حجم مل 4 أنبوب البولي نابذة فائقة السرعة.
- بلطف طبقة بوروميسين تعامل كسور شطف على رأس وسادة ، وعينات من الطرد المركزي في 100000 XG بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة أنابيب الطرد المركزي من الدوار ، ونضح supernatants.
- يغسل كريات تحتوي على ريبوسوم المنقى مرتين مع 1 مل من وسادة عازلة.
- Resuspend ريبوسوم في 100 ميكرولتر من وسادة عازلة عن اضطراب طيف باستخدام قضيب الزجاج.
- بعد انقطاع ، مع تغطية أنابيب parafilm ويهز بسرعة معتدلة في دوامة غرفة باردة لمدة ساعة.
- نقل المحتويات إلى أنبوب microcentrifuge ، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على أقصى سرعة عند 4 درجة مئوية ، وإزالة supernatants لأنابيب جديدة.
- كرر الخطوات 4،1-4،7 باستخدام 2 مل من وسادة عازلة ، إلا أن 100 من ميكرولتر العازلة التخزين (50 ملي HEPES KOH - 7.6 درجة الحموضة ، 50 ملي NH 4 CL ، 5 ملغ ملي(OAC) 2 ، ويستخدم 1 ملم DTT ، الجلسرين 25 ٪) في خطوات 4.4 و 4.5 بدلا من وسادة عازلة.
- قياس ريبوسوم المنقى spectrophotometrically (1 A 260 = 20 من pmoles ريبوسوم الخميرة) ، وتخزينها في -80 درجة مئوية. نتائج نموذجية من 1 غرام من الخميرة هي 300-400 pmoles من ريبوسوم.
5. ممثل النتائج :
ويظهر مثال الأنواع المستخرجة من الحمض النووي الريبي كل خطوة من الخطوات الرئيسية الثلاثة للبروتوكول في الشكل 2. بينما rRNAs هي الأنواع الرئيسية الموجودة في الخلية lysates الكلي (T) هذه أيضا تحتوي على عدد كبير من الأنواع الأخرى الحمض النووي الريبي. ريبوسوم تنقيته من العمود Sulfolink (SL) تحتوي أيضا على كمية كبيرة من tRNAs نظرا لتقارب عالية من السرير العمود لهذه الأنواع أيضا. علاج هذا الكسر مع نتائج بوروميسين في التحلل من الببتيدات من ببتيديل - tRNAs ، ويشجع تفارق هذه الأنواع من الريبوزومات. وبوروميسين معاملة عينات (بعد الظهر) عدم المشاركة في purifyinز الأنواع الحمض الريبي النووي النقال ، وبالتالي تمثل ريبوسوم نقية تماما. كما ذكرت سابقا 8 ، وهذه ريبوسوم سليمة ونشطة جدا كيميائيا ، مما يجعلها مثالية للركائز التحليلات التفصيلية الفنية والهيكلية.
الشكل 1. مخطط انسيابي الأسلوب. يصور تنقية الكروماتوغرافي من ريبوسوم باستخدام ربط السيستين sulfolink الراتنج.
الشكل 2. تم استخراج تحليل ممثل الاستعدادات الريبوسوم. مجموع الأنواع من الحمض النووي الريبي lysates الخلية الكلي (T) ، Sulfolink ريبوسوم المنقى (SL) وريبوسوم Sulfolink تنقية المعالجة في وقت لاحق مع وبوروميسين الرسوبية من خلال وسادة الجلسرين (بعد الظهر). حارة M يمثل حجم علامات الحمض النووي الريبي. يشار إلى العصابات وتمثل rRNAs 25S 18S ، فضلا عن غيرها من الأنواع tRNAs والحمض النووي الريبي. جميعتم تحميل الممرات مع 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكولات أساسية تشمل تنقية الريبوسوم الخلايا lysing وحصاد جزء من عصاري خلوي تدور بسرعة منخفضة ، والتكوير ثم ريبوسوم بواسطة الطرد المركزي بسرعة عالية 1. في حين تم استخدام أساليب الرواية قليلة لتنقية ريبوسوم البكتيرية ، وكان نفس لم ينطبق على حقيقيات النوى 2-4. على الرغم من أن تم إضافة خطوات إضافية على امتداد سنوات ، يغسل الملح على سبيل المثال ، والوسائد الجلسرين (انظر على سبيل المثال 5) ، وتعرقلت الدراسات البيوكيميائية والهيكلية للريبوسوم الخميرة التي ميلها لتصبح تدهورت بفعل الانزيمات الذاتية المهينة أثناء عملية تنقية ، وعلى الأرجح نظرا لفترات طويلة من الوقت خلال الخطوات تنبيذ فائق خلالها يتعرضون ريبوسوم لهذه الفئات من الانزيمات 6.
المشكلة الرئيسية المرتبطة البروتوكولات التقليدية هو شارك في تنقية والبروتياز nucleases مع الريبوزومات. هذه النتائج في تدهورها خلالعملية تنقية ، مما أدى إلى انخفاض العوائد من ريبوسوم النشطة كيميائيا. أدى ارتفاع مستويات البروتياز وnucleases موجودة في العزلات السريرية من البكتيريا المسببة للأمراض في تطوير طريقة لتنقية الريبوسوم الكروماتوغرافي باستخدام السيستين اتهم Sulfolink راتنج 7. وأظهرت rRNAs والبروتينات المستمدة من ريبوسوم البكتيرية المعزولة باستخدام هذا الأسلوب مستويات أقل بكثير من تدهور ، وحتى يطهر ريبوسوم كانت كبيرة أكثر قدرة على ربط الإريثروميسين ولتجميع البروتينات. كيمياء محددة ملزمة الريبوسوم إلى الراتنج Sulfolink غير معروف ، ومع ذلك فإنه قد تردد أن تنطوي على تفاعلات مسعور 7. هذه الملاحظات توحي بأن السيستين اتهم Sulfolink الأسلوب اللوني الراتنج ويمكن تطبيقها أيضا على ريبوسوم الخميرة ، وإذا كان الأمر كذلك ، وأنه يمكن أن يحل الكثير من المشاكل المذكورة أعلاه. وبالتالي نحن تكييف هذا البروتوكول لعزل سليمة ، ريبو الخميرة نشطة للغايةsomes. الأسلوب الكروماتوغرافي عمود بسرعة وكفاءة النتائج في فصل جزء كبير من تلويث nucleases والبروتياز من ريبوسوم الناتجة في أنقى ، وأكثر نشاطا كيميائيا الاستعدادات الريبوسوم مع تعزيز الخصائص البيوكيميائية والهيكلية ، التي موازين جيدا لكميات أكبر من ريبوسوم 8. لم تظهر أية فروق ذات دلالة على تغيير طبيعة البروتين هلام ريبوسوم تقليديا بين تلك المنقى والمنقى اللوني عبر عمود ، مشيرا إلى أن هذه ريبوسوم يحتوي على جميع العناصر نفسها كما الريباسي ريبوسوم المنقى تقليديا.
هناك بعض الخطوات في البروتوكول التي تتطلب اهتماما خاصا. فيما يتعلق اضطراب خلايا الخميرة والدقيق نسبة 1:1 من خلية إلى تعليق الخرز الزجاجي (المجلد / المجلد) أمر بالغ الأهمية. عادة ، تتعطل ~ 80 ٪ من الخلايا في 2 دقيقة. الأهم ، ينبغي تجنب الإفراط في اضطراب لمنع الافراج عن الانزيمات المهينة من عضيات الخلية.وإن كانت معروضة ريبوسوم الحصول عليها مباشرة من العمود Sulfolink أن تكون خالية تماما من ما يقرب من التلوث البروتيني وnuclease ، أشارت مراقبة مستويات عالية من الحمض الريبي النووي النقال في هذا الكسر أن الراتنج يربط الحمض الريبي النووي النقال و7،8 جيدا. لقد وجدنا أن وجود أنواع الحمض الريبي النووي النقال يتداخل مع فحوصات البيوكيميائية مثل المصب ملزمة الريبوسوم / يجند ، المقايسات النشاط ناقلة الببتيديل الرنا الريباسي والتحليلات الهيكلية. بوروميسين العلاج 9 من نتائج chromatographically ريبوسوم معزولة في إنتاج ببتيديل - بوروميسين ، والتي يتم تحريرها من ريبوسوم ، جنبا إلى جنب مع tRNAs deacylated 10-14. المباراة النهائية بين عشية وضحاها الطرد المركزي بسرعة عالية من خلال عينات وسادة الجلسرين هو أمر حاسم لإزالة tRNAs الحرة المتبقية من العينات الريبوسوم. إذا كانت هناك حاجة مفارز منفصلة ، قد يتم الحصول عليها عن طريق الترسيب من خلال التدرج الملح السكروز أعلى مستوى في 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر جميع أعضاء المختبر Dinman ، بما في ذلك Belew أشتون ، جاك كارين ، Musalga Sharmishtha ، Sulima سيرجي ريدي شيفاني ، ومايكل Rhodin لما قدموه من مساعدة والمساهمة في هذا المشروع. وأيد هذا العمل عن طريق منح لصباحا من جمعية القلب الأمريكية (AHA 0630163N) وJDD من المعاهد الوطنية للصحة (5R01 GM058859 - 12). وأيد جال قبل إعادة الاستثمار الأميركي وقانون الانتعاش عام 2009 تكملة لمنح الأم (3R01GM058859 - 11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).
