Summary
Forurening af præparater af eukaryote ribosomer renses ved traditionelle metoder ved co-rensende nucleaser og proteaser negativt virkninger på downstream-biokemiske og strukturelle analyser. En hurtig og enkel kromatografisk oprensning metoden anvendes til at løse dette problem ved hjælp af gær ribosomer som model system.
Abstract
Eukaryote ribosomer er meget mere labile i forhold til deres eubacterial og archael modstykker, og udgør derfor en stor udfordring for forskerne. Særligt generende er, at lyse af celler frigiver en lang række proteaser og nucleaser som kan forringe ribosomer. Derfor er det vigtigt at adskille ribosomer fra disse enzymer så hurtigt som muligt. Desværre, konventionelle forskellen ultracentrifugering metoder blade ribosomer udsat for disse enzymer til uacceptabelt lange perioder, påvirker deres strukturelle integritet og funktionalitet. For at løse dette problem, vi benytter en kromatografisk metode ved hjælp af en cystein opkrævet Sulfolink harpiks. Denne enkle og hurtige anvendelse reducerer co-rensende proteolytiske og nucleolytic aktiviteter, der producerer høje udbytter af intakt, meget biokemisk aktiv gær ribosomer. Vi foreslår, at denne metode også bør gælde for pattedyr ribosomer. Den enkelhedmetoden, og de forbedrede renhed og aktivitet chromatografisk renset ribosom repræsenterer et betydeligt teknisk fremskridt for studiet af eukaryote ribosomer.
Protocol
1. Udarbejdelse af en cystein opladet Sulfolink harpiks
- Forbered Sulfolink resin (Pierce) ved stuetemperatur.
- Placer en i alt 10 ml af en 50% opslæmning af Sulfolink kobling gel som leveret af fabrikanten i to 10 ml plastik hætteglas med 5 ml fordeles i hvert hætteglas.
- Kort centrifuge hætteglas ved 850 xg og fjern forsigtigt supernatanter.
- Vask gel tre gange i kobling buffer (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) ved opblandes perler i 5 ml, centrifugering kortvarigt ved 850 xg og fjernelse af supernatanten med pipette.
- Føje fem ml af en 50 mM opløsning af L-cystein i kobling buffer, til hvert rør og bland gyllen i 1 time ved 25 ° C.
- Fjern de resterende L-cystein ved at vaske, som beskrevet i trin 1.4 ovenfor.
- Resuspendér gel i 10 ml af bindende buffer [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mm Mg (OAC) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM DTT], og tempereres harpiksen ved at vaske i 10 ml af bindende buffer3 gange som beskrevet i trin 1.4. Omhældes harpiks i et 10 ml centrifugeglas kolonne, hætte og opbevares ved 4 ° C. Harpiksen kapacitet for RNA binding er ~ 20 en 260 enheder per ml.
2. Kromatografisk oprensning af ribosomer ved hjælp af en cystein opladet Sulfolink harpiks
Bemærk: Hvis der arbejder med en stamme, hvor protease aktivitet viser sig at være et problem, kan protease hæmning cocktails bruges i alle efterfølgende buffere.
- Bevar alle komponenter på is og forberede alle løsninger ved hjælp af RNase-frit vand og sterilt filtrering.
- Grow gærceller natten til medio logge fase (OD 595 = 0,6 til 1,2) i passende medier. Pellet celler ved centrifugering, og vask 1 gram celler i forpligtende buffer og centrifugeres ved 3700 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender cellerne i 1 ml af bindende buffer til en omtrentlig samlet volumen på 2 ml, og forstyrre ved hjælp af en lige så stor mængde på 0,5 mm glasperler nedkøles til 4 ° C usynge en Biospec Mini-perle tæppebanker (Bartlesville, OK). Prøver kan opdeles i flere rør efter behov.
- Fjern ubrudt celler, organeller, og celleaffald ved centrifugering ved 30.000 xg i 30 minutter i en Beckman Coulter-Optima Max E ultracentrifuge (Fullerton, CA).
- Umiddelbart før brug, harpiksen i et minut ved 1.000 pellet xg for at fjerne opbevaringsløsning. To ml af harpiks bruges til hver et gram af celler.
- Fjern celle lysat supernatanter fra de 30.000 xg spin (S30), der tager sig for at minimere forurening fra enten lipid fraktionen i det øverste eller cellen vragrester i bunden af rørene, og placer direkte ind i opkrævet Sulfolink gylle. Den lipid lag kan undgås enten ved fjernelse eller ved at skubbe ud fra pipetten efter spidsen har krydset ind i supernatanten.
- Inkubér S30/Sulfolink blandingen på is, uden at blande i 15 minutter.
- Placer kolonner i 15 ml koniske rør og centrifugeres ved 1.000 xgir et minut.
- Placer gennemstrømning fraktioner tilbage i kolonner, bland med hånden, og inkuber i yderligere 15 minutter på isen.
- Placer kolonner i 15 ml koniske rør og centrifugeres ved 1.000 xg i et minut. Kassér gennemstrømning.
- Cap kolonner og der tilsættes 5 ml af bindende buffer. Bland kolonner med hånden, indtil resuspenderet, fjern caps, og centrifuger kolonnerne centrifugen ved 1.000 xg i et minut. Gentag denne vask protokol to gange mere.
- Tilsæt 1,5 ml eluering buffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAC) 2, 500 mM KCl, 2mm DTT, 0,5 mg / ml heparin) til hver kolonne. Bland slam i hånden, og inkuber på is i 2 minutter
- Placer kolonner i nye 15 ml koniske rør og centrifugeres ved 1.000 xg i 1 minut. Saml eluatet. Gentag eluering skridt igen, så det endelige samlede prøvevolumener er ~ 3 ml. Brugt harpiks kan vaskes med eluering buffer uden heparin efterfulgt af ligevægt med bindende Buffer, og lagres i 10 ml mængder af bindende buffer ved 4 ° C for genbrug senere.
3. Puromycin behandling
Bemærk: En alternativ metode til at fjerne forurenende tRNA arter er at skifte fra en glukose rige til glukose udtømte medierne til at promovere ribosom afstrømning. Men dette ændrer den metaboliske status gærceller, som kan påvirke ribosom funktion og koncentration.
For at fratage ribosomer fra endogen peptidyl-tRNA, en behandling med puromycin er udført.
- Neutralisere til pH 7,5 100 mM puromycin ved tilsætning af 1 M KOH dråbevis ved stuetemperatur.
- Tilføj neutraliseret puromycin løsning på ~ 1mm endelige koncentration i eluatet.
- Tilsæt 100 mM GTP til en endelig koncentration på 1 mm.
- Inkuber i 30 minutter ved 30 ° C.
4. Rensning af ribosomer ved sedimentation gennem glycerol puder
- Anbring den ene mlaf pude buffer (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM Mg (OAC) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 25% glycerol) i en 4 ml volumen polycarbonat ultracentrifuge rør.
- Forsigtigt lag puromycin behandlet eluering fraktioner oven på puden, og centrifuger prøverne til 100.000 xg natten over ved 4 ° C.
- Fjern rør fra centrifugerotoren, og aspirér supernatanter.
- Vask piller med rensede ribosomer to gange med 1 ml pude buffer.
- Resuspender ribosomer i 100 μl af pude buffer ved forsigtig forstyrrelser med en glasstav.
- Efter afbrydelser, dække rør med parafilm og ryst på et moderat hastighed i et koldt rum vortex i en time.
- Overfør indholdet til en mikrocentrifugerør, centrifugeres i 5 minutter ved maksimal hastighed ved 4 ° C, og fjerne supernatanter til frisk rør.
- Gentag trin fra 4,1 til 4,7 med 2 ml pude buffer, og bortset fra, at 100 μl af storage buffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM NH 4 Cl, 5 mm Mg(OAC) 2, er 1 mM DTT, 25% glycerol), der anvendes i trin 4.4 og 4.5 i stedet for pude buffer.
- Kvantificere renset ribosomer spektrofotometrisk (1 A 260 = 20 pmoles af gær ribosomer), og opbevares ved -80 ° C. Typiske resultater fra 1 gram gær 300-400 pmoles af ribosomer.
5. Repræsentative resultater:
Et eksempel på RNA arter udvundet fra hver af de tre vigtigste trin i protokollen er vist i Figur 2. Mens rRNAs er de vigtigste arter, der findes i alt cellelysater (T) disse også indeholde en lang række andre RNA arter. Ribosomer renset fra Sulfolink kolonne (SL) også indeholder en stor mængde tRNAs grund af den høje affinitet af kolonnen sengen for disse arter også. Behandling af denne fraktion med puromycin resultater i hydrolyse af peptider fra peptidyl-tRNAs, og fremmer dissociation af disse arter fra ribosomer. Den puromycin behandlede prøver (PM) manglende co-purifying tRNA arter, og dermed repræsenterer helt ren ribosomer. Som tidligere rapporteret 8, disse ribosomer er meget intakt og biokemisk aktiv, hvilket gør dem ideelle substrater for detaljerede funktionelle og strukturelle analyser.
Figur 1. Metode Flowchart. Chromatografisk rensning af ribosomer ved hjælp af cystein forbundet sulfolink harpiks er afbildet.
Figur 2. Repræsentativ undersøgelse af ribosom præparater. Total RNA arter blev udvundet fra total cellelysater (T), Sulfolink renset ribosomer (SL) og Sulfolink renset ribosomer efterfølgende behandlet med puromycin og sedimenteres gennem en glycerol pude (PM). Lane M repræsenterer RNA størrelse markører. Bands, der repræsenterer 25S og 18S rRNAs, samt tRNAs og andre RNA arter er markeret. Allebaner blev lastet med 2 mg af RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ribosom rensning protokoller hovedsagelig tale lysering celler, høst et cytosol fraktion fra en lav hastighed spin, og derefter pelletering ribosomer ved høj hastighed centrifugering 1. Mens et par nye metoder har været brugt til rensning af bakterielle ribosomer, havde det samme ikke været tilfældet for eukaryoter 2-4. Selv om yderligere skridt er blevet tilføjet langs år, fx salt vasker, og glycerol hynder (se f.eks 5), har biokemiske og strukturelle studier af gær ribosomer blevet hæmmet af deres tendens til at blive nedbrudt af endogene enzymer under rensningsprocessen, sandsynligvis grund af den lange perioder i løbet af ultracentrifugering skridt, hvor ribosomer er udsat for disse klasser af enzymer 6.
Det største problem i forbindelse med traditionelle protokoller er co-rensning af proteaser og nucleaser med ribosomer. Dette resulterer i deres nedbrydning underrensningsprocessen, hvilket resulterer i lavere udbytter af biokemisk aktive ribosomer. De høje niveauer af proteaser og nucleaser til stede i kliniske isolater af sygdomsfremkaldende bakterier førte til udviklingen af en kromatografiske metode til ribosom rensning ved hjælp af en cystein opkrævet Sulfolink resin 7. Den rRNAs og proteiner fra bakterielle ribosomer isoleres ved hjælp af denne metode viste meget lavere niveauer af nedbrydningen, og ribosomer så renset var væsentligt bedre i stand til at binde erythromycin og til at syntetisere proteiner. De specifikke kemi ribosom binding til de Sulfolink harpiks er ukendt, men det har været spekuleret på, at det involverer hydrofobe interaktioner 7. Disse observationer foreslog, at cystein opkrævet Sulfolink resin kromatografi metoden også kan være gældende for gær ribosomer, og i bekræftende fald, at det kunne løse mange af de problemer, der er beskrevet ovenfor. Derfor har vi tilpasset denne protokol til isolering af intakt, meget aktive gær RiboSomes. Kolonnen kromatografiske metode hurtigt og effektivt resulterer i adskillelse af en betydelig del af forurenende nucleaser og proteaser fra ribosomer resulterer i renere og mere biokemisk aktive ribosom præparater med forbedret biokemiske og strukturelle egenskaber, som skalerer godt til større mængder af ribosomer 8. Ingen signifikante forskelle blev set på en denaturering proteingel mellem traditionelt renset ribosomer og dem, der renses på søjlekromatografi, hvilket indikerer, at disse ribosomer indeholder alle de samme ribosomale elementer som traditionelt renset ribosomer.
Der er nogle skridt i protokollen, der kræver særlig opmærksomhed. Med hensyn til afbrydelse af gærceller, er en præcis forholdet 1:1 cellesuspension til glas perler (vol / vol) kritisk. Typisk er ~ 80% af cellerne afbrydes i 2 min. Vigtigere er det, skal over-forstyrrelser undgås for at forhindre udslip af nedbrydende enzymer fra cellens organeller.Selvom ribosomer fås direkte fra Sulfolink kolonnen viste sig at være næsten helt fri for protease og nuklease forurening, observation af høje niveauer af tRNA i denne fraktion viste, at harpiksen binder tRNA samt 7,8. Vi har fundet, at tilstedeværelsen af tRNA arter kolliderer med downstream biokemiske analyser f.eks ribosom / ligandbinding, analyser af peptidyltransferase aktivitet og rRNA strukturelle analyser. Puromycin behandling 9 af chromatografisk isolerede ribosomer resulterer i produktion af peptidyl-puromycin, der er frigivet fra ribosomer, sammen med deacylated tRNAs 10-14. Den endelige natten høj hastighed centrifugering af prøver gennem en glycerol pude er afgørende for at fjerne de resterende fri tRNAs fra ribosomet prøver. Hvis separate subunits er påkrævet, kan de fås ved sedimentation gennem en høj salt saccharose gradient 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi ønsker at takke alle medlemmerne af Dinman laboratoriet, herunder Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, og Michael Rhodin for deres hjælp og input på dette projekt. Dette arbejde blev støttet af tilskud til AM fra American Heart Association (AHA 0630163N) og JDD fra National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL blev understøttet af en amerikansk Reinvestering og Recovery Act of 2009 supplement til den forælder, tilskud (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).
