Summary
La contamination des préparations de ribosomes eucaryotes purifié par les méthodes traditionnelles par les co-purifiant nucléases et protéases une incidence négative sur l'aval des analyses biochimiques et structurelles. Une méthode de purification chromatographique rapide et simple est utilisée pour résoudre ce problème en utilisant des ribosomes levure comme système modèle.
Abstract
Ribosomes eucaryotes sont beaucoup plus labiles par rapport à leurs homologues eubactériennes et archael, posant ainsi un défi important pour les chercheurs. Particulièrement gênant est le fait que la lyse des cellules libère un grand nombre de protéases et nucléases qui peut dégrader les ribosomes. Ainsi, il est important de séparer les ribosomes de ces enzymes aussi rapidement que possible. Malheureusement, les méthodes classiques ultracentrifugation différentielle feuilles ribosomes exposés à ces enzymes pour des périodes trop longues de temps, des répercussions sur leur intégrité structurelle et la fonctionnalité. Pour résoudre ce problème, nous utilisons une méthode chromatographique en utilisant une cystéine chargé Sulfolink résine. Cette application simple et rapide réduit considérablement la co-purifiant activités protéolytiques et nucléolytique, produisant des rendements élevés intacte, les ribosomes levure hautement biochimiquement active. Nous suggérons que cette méthode devrait également être applicable aux ribosomes de mammifères. La simplicité dela méthode, et la pureté améliorée et l'activité des ribosomes purifié par Chromatographie représente un progrès technique important pour l'étude des ribosomes eucaryotes.
Protocol
1. Préparation d'une cystéine chargé Sulfolink de résine
- Préparer Sulfolink résine (Pierce) à température ambiante.
- Placer un total de 10 ml d'une suspension de 50% de gel de couplage Sulfolink tel que fourni par le fabricant dans deux flacons de 10 ml en plastique, avec 5 ml distribué dans chaque flacon.
- Centrifuger brièvement flacons à 850 xg et retirez soigneusement surnageants.
- Lavez les trois gel de fois dans le tampon de couplage (50 mM Tris, pH 8,5, EDTA 5 mM) par remise en suspension des billes dans 5 ml, centrifuger brièvement à 850 xg et élimination du surnageant à la pipette.
- Ajoutez cinq ml d'une solution 50 mM de L-cystéine dans le tampon de couplage à chaque tube et mélanger le lisier pendant 1 heure à 25 ° C.
- Enlever le résidu L-cystéine par un lavage comme décrit dans l'étape 1.4 ci-dessus.
- Reprendre le gel dans 10 ml de tampon de liaison [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM de Mg (OAc) 2, 60 mM de NH 4 Cl, 2 mM DTT], et équilibrer la résine par lavage dans 10 ml de tampon de liaison3 fois comme décrit dans l'étape 1.4. Décanter la résine dans une colonne de 10 ml par centrifugation, casquette et conservés à 4 ° C. La capacité de la résine pour la liaison à l'ARN est ~ 20 A 260 unités par ml.
2. Purification chromatographique des ribosomes en utilisant une cystéine chargé Sulfolink de résine
Remarque: Si vous travaillez avec une souche où l'activité de la protéase se révèle être un problème, cocktails inhibition des protéases peut être utilisé dans tous les tampons suivants.
- Maintenir tous les composants sur la glace et préparer toutes les solutions utilisant l'eau sans RNase et la filtration stérile.
- Cultivez les cellules de levure nuit à la mi-phase log (DO 595 = 0,6 - 1,2) dans les médias appropriés. Cellules par centrifugation, et laver les cellules 1 gramme dans le tampon de liaison et centrifuger à 3700 xg pendant 5 minutes à 4 ° C.
- Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon de liaison à un volume total approximatif de 2 ml, et de perturber l'aide d'un volume égal à 0,5 mm de perles de verre réfrigéré à 4 ° C uchanter une Biospec Mini-perles batteur (Bartlesville, OK). Les échantillons peuvent être divisés en plusieurs tubes, au besoin.
- Retirer les cellules ininterrompue, les organites, et les débris cellulaires par centrifugation à 30000 xg pendant 30 minutes dans une ultracentrifugeuse Beckman-Coulter Optima Max E (Fullerton, CA).
- Immédiatement avant utilisation, granulés de la résine pendant une minute à 1000 xg pour éliminer la solution de stockage. Deux ml de résine est utilisée pour chaque gramme de cellules.
- Retirer surnageants lysat cellulaire de la vrille 30000 xg (S30), en prenant soin de minimiser la contamination soit de la fraction lipidique au sommet ou les débris cellulaires au fond des tubes, et placer directement dans la boue Sulfolink facturés. La couche lipidique peut être évité soit par enlèvement ou en poussant à partir de la pipette, après la pointe a traversé dans le surnageant.
- Incuber le mélange S30/Sulfolink sur la glace sans mélanger pendant 15 minutes.
- Placer les colonnes dans 15 ml tubes coniques et centrifuger à 1000 xg pendantr une minute.
- Placer les fractions accréditives retour dans les colonnes, mélanger à la main, et incuber pendant encore 15 minutes sur la glace.
- Placer les colonnes dans 15 ml tubes coniques et centrifuger à 1000 xg pendant une minute. Jeter les actions accréditives.
- Cap colonnes et ajouter 5 ml de tampon de liaison. Mélanger à la main jusqu'à colonnes resuspendues, enlever les bouchons et centrifuger la centrifugeuse colonnes à 1000 xg pendant une minute. Répétez ce protocole de lavage deux fois plus.
- Ajouter 1,5 ml de tampon d'élution (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM de KCl, 2 mM de DTT, 0,5 mg / ml d'héparine) pour chaque colonne. Mélanger boues à la main, et incuber sur glace pendant 2 minutes
- Placer les colonnes dans de nouveaux tubes coniques de 15 ml et centrifuger à 1000 xg pendant 1 minute. Recueillir l'éluat. Répétez l'étape d'élution fois de plus pour que les derniers volumes de l'échantillon combiné sont ~ 3 ml. Résine utilisée peut être lavée avec un tampon d'élution sans héparine et suivie par équilibration avec Buffe contraignanter, et stockés dans 10 volumes ml de tampon de liaison à 4 ° C pour les réutiliser plus tard.
3. Traitement de puromycine
Note: Une méthode alternative pour enlever la contamination des espèces ARNt est de passer d'un glucose riche pour les médias afin de promouvoir le glucose appauvri les eaux de ruissellement des ribosomes. Toutefois, cela ne change l'état métabolique des cellules de levure, ce qui pourrait affecter la fonction du ribosome et la concentration.
Pour dépouiller les ribosomes endogènes du peptidyl-ARNt, un traitement avec puromycine est effectuée.
- Neutraliser à pH 7,5 100 mM solution de puromycine en ajoutant goutte à goutte de KOH 1M à température ambiante.
- Ajouter la solution neutralisée à la puromycine ~ 1 mM concentration finale dans l'éluat.
- Ajouter 100 mM GTP à une concentration finale de 1 mM.
- Incuber pendant 30 minutes à 30 ° C.
4. Purification des ribosomes par sédimentation grâce à des coussins de glycérol
- Placer un mlde tampon coussin (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM de KCl, 2 mM de DTT, glycérol 25%) dans un tube de 4 volumes ultracentrifugeuse ml en polycarbonate.
- Délicatement la couche puromycine traités fractions d'élution sur le dessus du coussin, et des échantillons de centrifugation à 100.000 xg nuit à 4 ° C.
- Retirer les tubes de l'rotor de la centrifugeuse, et aspirer surnageants.
- Laver des pastilles contenant des ribosomes purifié deux fois avec 1 ml de tampon de coussin.
- Resuspendre ribosomes dans 100 ul de tampon coussin par des perturbations douces en utilisant une tige de verre.
- Après les perturbations, couvrir les tubes avec du parafilm et agiter à une vitesse modérée dans un tourbillon chambre froide pendant une heure.
- Transférer le contenu dans un tube à centrifuger, centrifuger pendant 5 minutes à vitesse maximale à 4 ° C, et de supprimer les surnageants dans des tubes frais.
- Répétez les étapes 04/01 au 04/07 avec 2 ml de tampon coussin et, sauf que ul 100 de stockage tampon (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM de NH 4 Cl, 5 mM de Mg(OAc) 2, DTT 1 mM, glycérol 25%) est utilisé dans les étapes 4.4 et 4.5 au lieu de tampon coussin.
- Quantifier les ribosomes purifiée par spectrophotométrie (1 A 260 = 20 pmoles de ribosomes de levure), et conserver à -80 ° C. Les résultats typiques d'1 gramme de levure sont de 300 à 400 pmoles de ribosomes.
5. Les résultats représentatifs:
Un exemple d'espèces d'ARN extrait de chacune des trois grandes étapes de ce protocole est montré dans la figure 2. Alors que les ARNr sont les principales espèces présentes dans les lysats cellulaires totaux (T), ces contiennent également un grand nombre d'espèces d'ARN d'autres. Les ribosomes purifiée à partir de la colonne Sulfolink (SL) contiennent également une grande quantité d'ARNt en raison de la forte affinité du lit de la colonne pour ces espèces ainsi. Le traitement de cette fraction avec des résultats puromycine dans l'hydrolyse des peptides issus de la peptidyl-ARNt, et favorise la dissociation de ces espèces de ribosomes. La puromycine échantillons traités (Pm) l'absence de co-purifying espèces ARNt, et représentent donc des ribosomes complètement pur. Comme indiqué précédemment 8, ces ribosomes sont très intact et biochimiquement active, ce qui les rend idéales pour les substrats détaillée des analyses fonctionnelles et structurelles.
Figure 1. Organigramme méthode. Purification chromatographique des ribosomes utilisant la cystéine liée sulfolink résine est représenté.
Figure 2. Représentant l'analyse des préparations ribosome. Espèces d'ARN total ont été extraites à partir de lysats cellulaires totaux (T), Sulfolink ribosomes purifié (SL) et purifiée ribosomes Sulfolink ensuite traité par la puromycine et sédimenté à travers un coussin de glycérol (Pm). Lane M représente la taille des marqueurs ARN. Bandes représentant ARNr 25S et 18S, ainsi que les ARNt et d'autres espèces d'ARN sont indiqués. Tous lesvoies ont été chargées avec 2 ug d'ARN.
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Discussion
Protocoles de purification ribosome essentiellement impliquent lyse des cellules, la récolte d'une fraction cytosolique d'une vrille à basse vitesse, puis granulation ribosomes par centrifugation à grande vitesse 1. Bien qu'un peu de nouvelles méthodes ont été utilisées pour la purification de ribosomes bactériens, le même n'avait pas été vrai pour les eucaryotes 2-4. Bien que des mesures supplémentaires ont été ajoutés au fil des années, se lave le sel par exemple, et les coussins de glycérol (voir par exemple 5), des études biochimiques et structurales des ribosomes de levure ont été entravés par leur tendance à devenir endogènes dégradées par des enzymes dégradant durant le processus de purification, le plus probable en raison de la longue période de temps durant les étapes d'ultracentrifugation pendant laquelle les ribosomes sont exposés à ces classes d'enzymes 6.
Le principal problème associé aux protocoles traditionnels est le co-purification des protéases et nucléases aux ribosomes. Cela se traduit dans leur dégradation au coursle processus de purification, entraînant une baisse des rendements des ribosomes biochimiquement active. Les niveaux élevés de protéases et nucléases présentes dans les isolats cliniques de bactéries pathogènes a conduit à l'élaboration d'une méthode chromatographique pour la purification de ribosomes en utilisant une cystéine chargé Sulfolink résine 7. Les ARNr et les protéines issues de ribosomes bactériens isolés en utilisant cette méthode ont montré des niveaux beaucoup plus bas de la dégradation, et les ribosomes ainsi purifié étaient significativement plus capable de se lier l'érythromycine et à synthétiser des protéines. La chimie spécifique de fixation du ribosome à la résine Sulfolink est inconnue, mais il a été spéculé que cela implique des interactions hydrophobes 7. Ces observations suggèrent que la cystéine chargé méthode de chromatographie sur résine Sulfolink peut aussi être applicable aux ribosomes de la levure, et si oui, que cela pourrait résoudre bon nombre des problèmes décrits ci-dessus. Ainsi, nous avons adapté ce protocole pour l'isolement des intacte, ribo levure hautement activesomes. La méthode chromatographique sur colonne rapidement et efficacement des résultats de la séparation d'une fraction importante de contamination des nucléases et protéases des ribosomes résultant en plus pur, plus biochimiquement active les préparatifs ribosome avec de meilleures propriétés biochimiques et structurales, qui monte bien à la hausse des quantités de ribosomes 8. Aucune différence significative n'a été observée sur un gel dénaturant de protéines entre les ribosomes, traditionnellement épurée et ceux purifié par chromatographie sur colonne, ce qui indique que ces ribosomes contiennent tous les mêmes éléments que les ribosomes ribosomique traditionnellement purifiée.
Il ya quelques étapes dans le protocole qui nécessitent une attention particulière. En ce qui concerne la perturbation des cellules de levure, un ratio de 1:1 précise de la suspension cellulaire à des billes de verre (vol / vol) est critique. Typiquement, ~ 80% des cellules sont perturbés en 2 min. Il est important, plus les perturbations devraient-être évitées pour empêcher la libération d'enzymes dégradant des organites cellulaires.Bien que les ribosomes obtenus directement à partir de la colonne Sulfolink se sont avérés être presque complètement libre de toute contamination de la protéase et la nucléase, l'observation de niveaux élevés d'ARNt dans cette fraction a indiqué que la résine lie ARNt ainsi 7,8. Nous avons constaté que la présence d'espèces d'ARNt interfère avec l'aval des dosages biochimiques ex liaison au ribosome / ligand, des dosages de l'activité et des analyses peptidyltransferase ARNr structurelles. Puromycine traitement 9 de chromatographie résultats ribosomes isolés dans la production du peptidyl-puromycine, qui est libéré par les ribosomes, avec ARNt désacylé 10-14. La finale de centrifugation à grande vitesse durant la nuit d'échantillons à travers un coussin de glycérol est essentiel pour éliminer l'ARNt libre restant dans les échantillons des ribosomes. Si les sous-unités distinctes sont nécessaires, elles peuvent être obtenues par sédimentation à travers un gradient de saccharose élevée de sel 15
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Dinman, y compris Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, et Michael Rhodin pour leur aide et leur participation à ce projet. Ce travail a été soutenu par des subventions à l'AM de l'American Heart Association (AHA 0630163N) et à partir du JDD National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL a été soutenue par un réinvestissement américains et Recovery Act de 2009 supplément à la subvention des parents (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
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