Summary
Die Kontamination von Zubereitungen der eukaryotischen Ribosomen mit herkömmlichen Methoden durch Co-Reinigung Nukleasen und Proteasen gereinigt negativ auf die nachgelagerten biochemische und strukturelle Analysen. Eine schnelle und einfache chromatographische Reinigungsverfahren wird verwendet, um dieses Problem unter Verwendung von Hefe Ribosomen als Modellsystem zu lösen.
Abstract
Eukaryotischen Ribosomen sind sehr viel labiler als ihre eubakterielle und archael Pendants verglichen, so dass damit eine bedeutende Herausforderung für die Forscher. Besonders störend ist die Tatsache, dass die Lyse von Zellen eine große Anzahl von Proteasen und Nukleasen, die Ribosomen abbauen können Releases. Daher ist es wichtig, dass Ribosomen aus dieser Enzyme so schnell wie möglich zu trennen. Leider lässt herkömmlicher Differenzialsperren Ultrazentrifugation Methoden Ribosomen, die mit diesen Enzymen für unvertretbar lange Zeiträume, die Einfluss auf die strukturelle Integrität und Funktionalität. Um dieses Problem anzugehen, setzen wir ein chromatographisches Verfahren mit einem Cystein berechnet SulfoLink Harz. Diese einfache und schnelle Anwendung deutlich reduziert Co-Reinigung proteolytische und nucleolytischen Aktivitäten, hohe Erträge von intakten, sehr biochemisch aktive Hefe Ribosomen. Wir schlagen vor, dass diese Methode auch anwendbar sein Säugetier-Ribosomen. Die Einfachheit derdie Methode und die verstärkte Reinheit und Aktivität der chromatographisch gereinigten Ribosomen stellt einen bedeutenden technischen Fortschritt für das Studium der eukaryotischen Ribosomen.
Protocol
1. Erstellung eines Cystein berechnet SulfoLink Harz
- Bereiten SulfoLink Harz (Pierce) bei Raumtemperatur.
- Legen Sie insgesamt 10 ml einer 50% igen Aufschlämmung von SulfoLink Ultraschallgel, wie vom Hersteller in zwei 10 ml Kunststoff-Flaschen geliefert, mit 5 ml in jedes Fläschchen verteilt.
- Kurz Zentrifuge Ampullen bei 850 xg und entfernen Sie vorsichtig Überstände.
- Wash Gel dreimal in Bindungspuffer (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) durch Resuspendieren der Beads in 5 ml, kurze Zentrifugation bei 850 xg und Entfernen des Überstandes mit einer Pipette.
- Fügen Sie fünf ml einer 50 mM Lösung von L-Cystein in Kupplungspuffer in jedes Röhrchen und mischen Sie die Suspension 1 Stunde bei 25 ° C.
- Entfernen Sie die verbleibenden L-Cystein durch Waschen wie in Schritt 1.4 beschrieben.
- Resuspendieren das Gel in 10 ml Bindungspuffer [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM Mg (OAc) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM DTT] und äquilibrieren das Harz durch Waschen in 10 ml Bindungspuffer3-mal, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Dekantieren Harz in einem 10 ml-Zentrifugenröhrchen Spalte, Kappe und bei 4 ° C. Das Harz Kapazität für RNA-Bindung ~ 20 A 260 Einheiten pro ml.
2. Chromatographische Reinigung von Ribosomen mit einem Cystein berechnet SulfoLink Harz
Hinweis: Bei der Arbeit mit einem Stamm, wo Protease-Aktivität erweist sich als ein Problem sein, Proteaseinhibierung Cocktails können in allen nachfolgenden Puffer verwendet werden.
- Pflegen Sie alle Komponenten auf Eis und bereiten alle Lösungen mit RNase-freiem Wasser-und Sterilfiltration.
- Wachsen Hefezellen über Nacht zum mittleren Log-Phase (OD 595 = 0,6 bis 1,2) in geeigneten Medien. Pellet-Zellen durch Zentrifugation und Waschen 1 Gramm Zellen in Bindungspuffer und Zentrifuge bei 3700 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Die Zellen in 1 ml Bindungspuffer, um eine ungefähre Gesamtvolumen von 2 ml, und stören mit dem gleichen Volumen von 0,5 mm Glasperlen gekühlt auf 4 ° C usingen ein Biospec Mini-Bead Beater (Bartlesville, OK). Die Proben können in mehrere Rohre geteilt werden, wie gebraucht.
- Entfernen Sie aufgebrochene Zellen, Organellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 30.000 xg für 30 Minuten in einer Beckman-Coulter Optima Max E Ultrazentrifuge (Fullerton, CA).
- Unmittelbar vor dem Gebrauch Pellet der Harz für 1 Minute bei 1.000 xg, um die Storage-Lösung zu entfernen. Zwei ml Harz ist für jeden ein Gramm Zellen verwendet.
- Entfernen Zelllysat Überstände von den 30.000 xg Spin (S30), wobei darauf zu Verunreinigungen entweder aus der Lipid-Fraktion an die Spitze oder die Zelltrümmer am Boden der Rohre, und direkt in die Rechnung SulfoLink Gülle zu minimieren. Die Lipidschicht kann entweder durch Beseitigung oder durch Ausstoßen aus der Pipette nach der Spitze in den Überstand überquert hat vermieden werden.
- Inkubieren Sie die S30/Sulfolink Mischung auf Eis ohne Mischen für 15 Minuten.
- Legen Sie die Spalten in 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 1.000 xg fürr 1 Minute.
- Setzen Sie den Durchfluss Fraktionen zurück in die Spalten, mischen von Hand, und inkubieren für weitere 15 Minuten auf Eis.
- Legen Sie die Spalten in 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 1.000 xg für 1 Minute. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Cap Spalten und 5 ml Bindungspuffer. Mix Spalten von Hand bis resuspendiert, entfernen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie die Spalten Zentrifuge bei 1.000 xg für 1 Minute. Wiederholen Sie diesen Wasch-Protokoll zwei weitere Male.
- Fügen Sie 1,5 ml Elutionspuffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 0,5 mg / ml Heparin), um jede Spalte. Mix Schlämme von Hand, und auf Eis inkubieren für 2 Minuten
- Legen Sie Spalten in neue 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 1.000 xg für 1 Minute. Sammeln Eluat. Wiederholen Sie den Elutions noch einmal so, dass die endgültige Kombination Probenvolumina ~ 3 ml sind. Gebrauchte Harz kann mit Elutionspuffer ohne Heparin gewaschen und anschließend durch Äquilibrierung mit verbindlichen buffer, und in 10 ml Volumen Bindungspuffer bei 4 ° C für die Wiederverwendung später gespeichert.
3. Puromycin-Behandlung
Hinweis: Eine alternative Methode zur Entfernung kontaminierender tRNA-Spezies ist es, aus einer Glucose reich an Glucose verbraucht Medien Ribosom Abfluss zu fördern wechseln. Allerdings ändert das die metabolischen Status der Hefezellen, die Ribosomen-Funktion und Konzentration beeinträchtigen könnten.
Um die Ribosomen aus endogenen Peptidyl-tRNA, eine Behandlung mit Puromycin durchgeführt Streifen.
- Neutralisieren auf pH 7,5 100 mM Puromycin Lösung durch Zugabe von 1M KOH tropfenweise bei Raumtemperatur.
- Add neutralisiert Puromycin Lösung ~ 1mm Endkonzentration im Eluat.
- Add 100 mM GTP zu einer Endkonzentration von 1 mM.
- Inkubieren für 30 Minuten bei 30 ° C.
4. Reinigung von Ribosomen durch Sedimentation durch Glycerin Kissen
- Legen Sie eine mlvon Polster-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 25% Glycerin) in ein 4 ml Volumen Polycarbonat Ultrazentrifuge Röhre.
- Vorsichtig Schicht Puromycin Elutionsfraktionen auf der Oberseite des Kissens und Zentrifuge Proben bei 100.000 xg bei 4 ° C über Nacht behandelt
- Nehmen Sie Rohre aus dem Zentrifugenrotor, und saugen Überstände.
- Wash Pellets gereinigt Ribosomen zweimal mit 1 ml der Kissen-Puffer.
- Resuspendieren Ribosomen in 100 ul Kissen Puffer durch vorsichtiges Störung mit einem Glasstab.
- Nach Unterbrechungen, decken Rohre mit Parafilm und schütteln mit mäßiger Geschwindigkeit in einem kalten Raum Wirbel für eine Stunde.
- Übertragen Sie den Inhalt in ein Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifuge für 5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 ° C, und entfernen Sie Überstände an die frische Röhren.
- Wiederholen Sie die Schritte von 4,1 bis 4,7 mit 2 ml Puffer und Polster, außer dass 100 ul der Pufferspeicher (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAc) 2, 1 mM DTT, 25% Glycerin) in Schritten 4.4 und 4.5 statt Kissen Puffer verwendet.
- Quantifizierung der gereinigten Ribosomen spektrophotometrisch (1 A 260 = 20 pMol Hefe Ribosomen) und bei -80 ° C. Typische Ergebnisse von 1 Gramm Hefe sind 300-400 pmol Ribosomen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel für RNA-Spezies aus jedem der drei großen Schritte des Protokolls extrahiert wird in Abbildung 2 dargestellt. Während rRNAs sind die wichtigsten Arten, die in insgesamt Zelllysaten (T) enthält auch diese eine große Anzahl von anderen RNA-Spezies. Ribosomen aus dem SulfoLink Spalte (SL) gereinigt enthalten auch eine große Menge von tRNAs durch die hohe Affinität der Spalte Bett für diese Arten auch. Die Behandlung dieser Fraktion mit Puromycin führt zur Hydrolyse von Peptiden aus Peptidyl-tRNAs und fördert Dissoziation dieser Arten aus Ribosomen. Die Puromycin behandelten Proben (Pm) mangelnde Zusammenarbeit purifying tRNA-Spezies, und stellen damit vollkommen rein Ribosomen. Wie bereits 8 berichtet, sind diese Ribosomen sehr intakt und biochemisch aktiver, wodurch sie ideal Substrate für detaillierte funktionelle und strukturelle Analysen.
Abbildung 1. Methode Flowchart. Chromatographische Reinigung von Ribosomen mit dem Cystein verknüpft SulfoLink Harz dargestellt.
Abbildung 2. Vertreter Analyse von Ribosomen Zubereitungen. Gesamt-RNA Spezies wurden aus insgesamt Zelllysaten (T), SulfoLink gereinigt Ribosomen (SL) und SulfoLink gereinigt Ribosomen anschließend mit Puromycin behandelt extrahiert und sedimentiert durch eine Glycerin Kissen (PM). Lane M steht für RNA-Größenmarker. Bands vertreten 25S-und 18S-rRNA, sowie tRNAs und anderen RNA-Spezies sind angegeben. AlleBahnen wurden mit 2 pg RNA geladen.
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Discussion
Ribosomen Aufreinigungsprotokolle grundsätzlich um Zellen zu lysieren, die Ernte einer cytosolischen Fraktion aus einer niedrigen Geschwindigkeit drehen, und dann Pelletierung Ribosomen durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation 1. Während ein paar neue Methoden zur Reinigung von bakteriellen Ribosomen verwendet wurden, hatte das gleiche nicht für Eukaryoten 2-4 wahr. Obwohl zusätzliche Schritte im Laufe der Jahre, wie zB Salz wäscht, und Glycerin Kissen (siehe zB 5) hinzugefügt worden sind, haben biochemische und strukturelle Untersuchungen von Hefe Ribosomen durch ihre Tendenz behindert zu werden abgebaut durch endogene Enzyme während des Reinigungsprozesses, wahrscheinlich aufgrund der langen Zeiträume während der Ultrazentrifugation Schritte während der Ribosomen zu diesen Klassen von Enzymen 6 ausgesetzt werden.
Das Hauptproblem bei herkömmlichen Protokollen verbunden ist Co-Reinigung von Proteasen und Nukleasen mit Ribosomen. Dies führt zu deren Abbau beiden Reinigungsprozess, was zu niedrigeren Renditen biochemisch aktive Ribosomen. Das hohe Niveau der Proteasen und Nukleasen in klinischen Isolaten von pathogenen Bakterien führten zur Entwicklung einer chromatographischen Methode zur Ribosom Reinigung mit einem Cystein berechnet SulfoLink Harz 7. Die rRNAs und Proteine aus bakteriellen Ribosomen isoliert mit dieser Methode abgeleitet zeigten ein viel niedrigeres Niveau des Abbaus und der Ribosomen so gereinigt wurden deutlich mehr in der Lage, Erythromycin zu binden und Proteine zu synthetisieren. Die spezifischen Chemie der Ribosomen-Bindung an die SulfoLink Harz ist unbekannt, aber es wurde spekuliert, dass es hydrophobe Wechselwirkungen umfasst insgesamt 7. Diese Beobachtungen legten nahe, dass die Cystein berechnet SulfoLink Harz-Chromatographie-Verfahren kann auch für Hefe Ribosomen, und wenn ja, dass es zu lösen viele der oben beschriebenen Probleme. So haben wir angepasst dieses Protokoll für die Isolierung von intakten, hoch aktive Hefe Ribosomen. Die säulenchromatographische Methode schnell und effizient Ergebnisse in Trennung einen erheblichen Teil der Kontamination Nukleasen und Proteasen, die aus Ribosomen was in reiner, biochemisch aktive Ribosom Präparate mit verbesserten biochemischen und strukturellen Eigenschaften, die sich sehr gut für größere Mengen von Ribosomen 8. Keine signifikanten Unterschiede wurden auf einem denaturierenden Protein-Gel zwischen traditionell gereinigten Ribosomen und den über Säulenchromatographie gesehen, was darauf hinweist, dass diese Ribosomen alle die gleichen Elemente wie ribosomale traditionell gereinigten Ribosomen enthalten.
Es gibt einige Schritte in Protokoll, das besondere Aufmerksamkeit erfordern. Im Hinblick auf Störungen der Hefezellen ist eine genaue Verhältnis von 1:1 Zellsuspension Glasperlen (vol / vol) kritisch. Typischerweise werden ~ 80% der Zellen in 2 min unterbrochen. Wichtig ist, dass über-Störungen vermieden werden, um die Freisetzung von Enzymen aus Zellorganellen zu verhindern.Obwohl Ribosomen direkt aus dem SulfoLink Säule erhalten erwiesen sich als fast völlig frei von Protease und Nuclease Kontamination, zeigte die Beobachtung von hohen tRNA in dieser Fraktion, dass das Harz tRNA bindet sowie 7,8. Wir haben festgestellt, dass die Anwesenheit von tRNA-Spezies mit nachgeschalteter biochemischer Assays Ribosom / Ligandenbindung Assays Peptidyltransferase Aktivität und rRNA Strukturanalysen z. B. stört. Puromycin-Behandlung 9 von chromatographisch isoliert Ribosomen Ergebnisse in der Produktion von Peptidyl-Puromycin, die von Ribosomen freigesetzt wird, zusammen mit deacylierten tRNAs 10-14. Die letzte Nacht Hochgeschwindigkeitszentrifugation von Proben durch eine Glycerin Kissen ist entscheidend für die Entfernung der restlichen freien tRNAs aus dem Ribosom Proben. Wenn getrennte Untereinheiten erforderlich sind, können sie durch Sedimentation durch einen hohen Salz-Saccharose-Gradienten 15 erhalten werden
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten alle Mitglieder der Dinman Labor, darunter Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, und Michael Rhodin für ihre Hilfe und Input bei diesem Projekt danken. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel unterstützt, von der American Heart Association (AHA 0630163N) AM und von den National Institutes of Health (5R01 GM058859-12) JDD. JAL wurde von einem amerikanischen Reinvestment and Recovery Act of 2009 Ergänzung zu den Eltern zu gewähren (3R01GM058859-11S1) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
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