Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Zusammenfassung

Die Kontamination von Zubereitungen der eukaryotischen Ribosomen mit herkömmlichen Methoden durch Co-Reinigung Nukleasen und Proteasen gereinigt negativ auf die nachgelagerten biochemische und strukturelle Analysen. Eine schnelle und einfache chromatographische Reinigungsverfahren wird verwendet, um dieses Problem unter Verwendung von Hefe Ribosomen als Modellsystem zu lösen.

Zusammenfassung

Eukaryotischen Ribosomen sind sehr viel labiler als ihre eubakterielle und archael Pendants verglichen, so dass damit eine bedeutende Herausforderung für die Forscher. Besonders störend ist die Tatsache, dass die Lyse von Zellen eine große Anzahl von Proteasen und Nukleasen, die Ribosomen abbauen können Releases. Daher ist es wichtig, dass Ribosomen aus dieser Enzyme so schnell wie möglich zu trennen. Leider lässt herkömmlicher Differenzialsperren Ultrazentrifugation Methoden Ribosomen, die mit diesen Enzymen für unvertretbar lange Zeiträume, die Einfluss auf die strukturelle Integrität und Funktionalität. Um dieses Problem anzugehen, setzen wir ein chromatographisches Verfahren mit einem Cystein berechnet SulfoLink Harz. Diese einfache und schnelle Anwendung deutlich reduziert Co-Reinigung proteolytische und nucleolytischen Aktivitäten, hohe Erträge von intakten, sehr biochemisch aktive Hefe Ribosomen. Wir schlagen vor, dass diese Methode auch anwendbar sein Säugetier-Ribosomen. Die Einfachheit derdie Methode und die verstärkte Reinheit und Aktivität der chromatographisch gereinigten Ribosomen stellt einen bedeutenden technischen Fortschritt für das Studium der eukaryotischen Ribosomen.

Protokoll

1. Erstellung eines Cystein berechnet SulfoLink Harz

1. Bereiten SulfoLink Harz (Pierce) bei Raumtemperatur.
2. Legen Sie insgesamt 10 ml einer 50% igen Aufschlämmung von SulfoLink Ultraschallgel, wie vom Hersteller in zwei 10 ml Kunststoff-Flaschen geliefert, mit 5 ml in jedes Fläschchen verteilt.
3. Kurz Zentrifuge Ampullen bei 850 xg und entfernen Sie vorsichtig Überstände.
4. Wash Gel dreimal in Bindungspuffer (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) durch Resuspendieren der Beads in 5 ml, kurze Zentrifugation bei 850 xg und Entfernen des Überstandes mit einer Pipette.
5. Fügen Sie fünf ml einer 50 mM Lösung von L-Cystein in Kupplungspu....

Diskussion

Ribosomen Aufreinigungsprotokolle grundsätzlich um Zellen zu lysieren, die Ernte einer cytosolischen Fraktion aus einer niedrigen Geschwindigkeit drehen, und dann Pelletierung Ribosomen durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation ^1. Während ein paar neue Methoden zur Reinigung von bakteriellen Ribosomen verwendet wurden, hatte das gleiche nicht für Eukaryoten ^2-4 wahr. Obwohl zusätzliche Schritte im Laufe der Jahre, wie zB Salz wäscht, und Glycerin Kissen (siehe zB ⁵⁾ hinzugefügt worden sin.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
SulfoLink Coupling Harz	Durchstechen	20402
Mini Bead-Beater 16	Biospec	607
Optima Max E Ultrazentrifuge	Beckman Coulter
Legend RT	Sorvall
0,5 mm Glasperlen	Biospec	11079105
Tris	Sigma-Aldrich	252859
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
DTT	Sigma-Aldrich	43815
HEPES	Sigma-Aldrich	54459
NH 4 Cl	Sigma-Aldrich	A9434
KCl	Sigma-Aldrich	60128
Mg (OAc) 2	Sigma-Aldrich	M5661
KOH	Sigma-Aldrich	221473
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Puromycin	Sigma-Aldrich	P7255
GTP	Fermentas	R0461