Summary
זיהום של ההכנות של הריבוזומים אוקריוטים מטוהרים באמצעות שיטות מסורתיות על ידי שיתוף טיהור nucleases ו פרוטאזות משפיע לרעה על ניתוחים ביוכימיים ומבניים במורד הזרם. שיטה מהירה ופשוטה טיהור chromatographic משמש כדי לפתור את הבעיה הזו באמצעות הריבוזומים שמרים כמערכת מודל.
Abstract
הריבוזומים האיקריוטים הם הרבה יותר יציב לעומת עמיתיהם eubacterial ו archael שלהם, ובכך פוזות אתגר משמעותי לחוקרים. מדאיג במיוחד הוא העובדה תמוגה של תאים משחרר מספר גדול של פרוטאזות ו nucleases אשר יכול לבזות הריבוזומים. לכן, חשוב להפריד בין הריבוזומים של אנזימים אלה מהר ככל האפשר. למרבה הצער, שיטות קונבנציונליות ultracentrifugation ההפרש עלים הריבוזומים חשופים אנזימים אלה לתקופות ארוכות של זמן בלתי מתקבל על הדעת, המשפיעים על השלמות המבנית ואת הפונקציונליות שלהם. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מנצלים שיטה chromatographic באמצעות ציסטאין טעונה Sulfolink שרף. יישום פשוטה ומהירה מפחית באופן משמעותי את שיתוף טיהור פעילויות proteolytic ו nucleolytic, ייצור של תשואות גבוהות, ריבוזומים שלמים שמרים מאוד פעיל ביוכימית. אנו מציעים שיטה זו צריך להיות גם ישים הריבוזומים יונקים. הפשטות שלהשיטה, ועל טוהר פעילות משופרת של הריבוזום מטוהרים chromatographically מייצג התקדמות טכניים משמעותיים לחקר הריבוזומים האיקריוטים.
Protocol
1. הכנת ציסטאין טעונה Sulfolink שרף
- הכן Sulfolink שרף (פירס) בטמפרטורת החדר.
- המקום כולל של 10 מ"ל של slurry של 50% ג'ל Sulfolink צימוד כפי שסופק בשתי צלוחיות פלסטיק 10 מ"ל על ידי היצרן, עם 5 מ"ל מופץ לתוך בקבוקון אחד.
- בקצרה צנטריפוגות מבחנות ב XG 850 ובזהירות להסיר supernatants.
- שטפו את הג'ל שלוש פעמים חיץ צימוד (50 מ"מ טריס, pH 8.5, 5 mM EDTA) על ידי resuspending את החרוזים 5 מ"ל, centrifuging בקצרה על 850 XG והסרת supernatant ידי פיפטה.
- מוסיפים חמש מיליליטר של תמיסה של 50 mM ציסטאין-L במאגר צימוד צינור כל תמהיל slurry שעה 1 במהירות של 25 ° C.
- הסר את שאריות L-ציסטאין ידי שטיפה כמתואר צעד 1.4 לעיל.
- Resuspend את הג'ל ב 10 מ"ל של חיץ מחייב [20 mM HEPES, pH 7.6, 5 מ"מ Mg (OAc) 2, 60 מ"מ NH 4 Cl, 2 מ"מ DTT], ואת לאזן שרף על ידי שטיפה ב 10 מ"ל של חיץ מחייב3 פעמים כמתואר בשלב 1.4. שרף למזוג לתוך 10 מ"ל צנטריפוגות כובע, עמודה מאוחסנים 4 ° C. קיבולת שרף עבור RNA מחייב הוא ~ 20 מ"ל 260 יחידות.
2. טיהור chromatographic של הריבוזומים באמצעות ציסטאין טעונה Sulfolink שרף
הערה: אם עובדים עם המתח שבו פעילות הפרוטאז מוכיחה להיות בעיה, עיכוב קוקטיילים פרוטאז ניתן להשתמש בכל מאגרי הבאים.
- שמרו את כל הרכיבים על הקרח ולהכין את כל פתרונות באמצעות RNase ללא מים סינון סטרילי.
- לגדל תאים שמרים לילה לשלב אמצע יומן (OD 595 = 0.6-1.2) במדיה המתאימה. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף 1 תאים גרם במאגר צנטריפוגות מחייב XG ב 3700 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- תאים Resuspend ב 1 מ"ל של חיץ מחייב נפח הכולל המשוער של 2 מ"ל, ולשבש באמצעות נפח שווה של 0.5 מ"מ חרוזי זכוכית מקורר עד 4 ° C uלשיר Biospec מיני חרוז מקצף (Bartlesville, בסדר). דוגמאות ניתן לפצל צינורות מרובים כנדרש.
- הסרה של תאים שלמים, אברונים, ופסולת תאית על ידי צנטריפוגה ב XG 30,000 במשך 30 דקות ב ultracentrifuge Beckman Coulter אופטימה-E מקס (Fullerton, CA).
- מיד לפני השימוש, גלולה שרף במשך דקה אחת ב 1000 XG להסיר את פתרון האחסון. שני מ"ל של שרף משמש גרם כל אחד של תאים.
- הסר lysate supernatants התא ספין 30,000 XG (S30), מטפלת כדי למזער את הזיהום מן השבר או שומנים בחלקו העליון או את הפסולת בתא בתחתית הצינורות, ואת המקום ישירות slurry Sulfolink טעונה. שכבת השומנים ניתן להימנע או על ידי הסרה או על ידי לחיצה מתוך pipet לאחר קצה חצה לתוך supernatant.
- דגירה את התערובת S30/Sulfolink על הקרח ללא ערבוב במשך 15 דקות.
- מניחים את עמודות תוך 15 צינורות חרוטי מ"ל ו צנטריפוגות XG ב 1000 עבורr דקה אחת.
- מקמו את השברים flowthrough בחזרה את העמודות, לערבב ביד, ואת לדגור עבור 15 דקות נוספות על הקרח.
- מניחים את עמודות תוך 15 צינורות חרוטי מ"ל ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך דקה אחת. בטל flowthrough.
- עמודות שווי ולהוסיף 5 מ"ל של חיץ מחייב. מערבבים ביד עד טורים resuspended, להסיר את כובעי, ו בצנטריפוגה צנטריפוגות עמודות XG ב 1000 למשך דקה אחת. חזור על פרוטוקול כביסה פעמיים נוספות.
- הוסף 1.5 מ"ל של חיץ elution (20 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 מ"מ KCl, 2mm DTT, 0.5 מ"ג / מ"ל הפרין) על כל עמודה. מערבבים slurries ביד, דגירה על קרח במשך 2 דקות
- המקום עמודות לתוך חדש 15 מ"ל צינורות חרוטי ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך דקה 1. איסוף eluate. חזור על השלב elution פעם נוספת, כך כרכים הסופי מדגם משולב הן ~ 3 מ"ל. שרף משמש ניתן לכבס עם חיץ elution ללא הפרין ואחריו איזון עם buffe מחייבr, ומאוחסנים 10 כרכים מ"ל של חיץ מחייב ב 4 ° C עבור שימוש חוזר מאוחר יותר.
3. Puromycin טיפול
הערה: שיטה חלופית כדי להסיר זיהום מינים tRNA הוא לעבור גלוקוז עשיר התקשורת גלוקוז מדולדל לקדם נגר הריבוזום. עם זאת, זה משנה את המצב המטבולי של התאים שמרים, אשר יכול להשפיע על התפקוד ועל ריכוז הריבוזום.
כדי להפשיט את הריבוזומים מ אנדוגני peptidyl-tRNA, טיפול עם puromycin מבוצע.
- כדי לנטרל את ה-pH 7.5 פתרון 100 מ"מ puromycin ידי הוספת 1M KOH dropwise בטמפרטורת החדר.
- הוסף פתרון puromycin לנטרל ריכוז 1mm ~ הסופי eluate.
- הוספת 100 מ"מ GTP לריכוז סופי של 1 מ"מ.
- דגירה במשך 30 דקות בקצב של 30 ° C.
4. טיהור של ריבוזומים על ידי שקיעה דרך כריות גליצרול
- מקום אחד מ"למאגר כרית (20 HEPES מ"מ, pH 7.6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 מ"מ KCl, 2 מ"מ DTT, גליצרול 25%) לתוך צינור 4 נפח מ"ל ultracentrifuge פוליקרבונט.
- בעדינות שכבה puromycin טיפול בשברים elution על גבי כרית, דגימות צנטריפוגות ב 100,000 XG לילה בשעה 4 ° C.
- הסר צינורות מן הרוטור צנטריפוגות, ואת לשאוב supernatants.
- לשטוף כדורי המכיל ריבוזומים מטוהרים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ כרית.
- Resuspend הריבוזומים של 100 μl של חיץ כרית על ידי שיבוש עדין בעזרת מוט זכוכית.
- לאחר הפרעה, לכסות עם צינורות parafilm ולנער במהירות בינונית במערבולת חדר קר במשך שעה אחת.
- מעבירים את תכולת לצינור microcentrifuge, צנטריפוגות במשך 5 דקות במהירות המרבית על 4 ° C, ולהסיר supernatants לצינורות טריים.
- חזור על שלבים 4.1-4.7 באמצעות 2 מ"ל של כרית חיץ, למעט 100 μl של חיץ אחסון (50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 50 מ"מ NH Cl 4, 5 מ"מ Mg(OAc) 2, 1 mM DTT, גליצרול 25%) משמש צעדים 4.4 ו - 4.5 במקום חיץ כרית.
- לכמת את הריבוזומים מטוהרים spectrophotometrically (1 260 = 20 pmoles של הריבוזומים שמרים), ולאחסן ב -80 ° C. תוצאות אופייניות של 1 גרם שמרים הם 300-400 pmoles של הריבוזומים.
5. נציג תוצאות:
דוגמה של מינים RNA המופק בכל אחד משלושת השלבים העיקריים של פרוטוקול מוצג באיור 2. בעוד rRNAs הם הזנים העיקריים נוכח lysates תא הכולל (T) אלה גם מכילים מספר רב של מינים אחרים RNA. הריבוזומים מטוהרים מהעמודה Sulfolink (SL) מכילים גם כמות גדולה של tRNAs בגלל זיקה גבוהה של המיטה עמודה עבור מינים אלה גם כן. הטיפול של חלק זה עם תוצאות puromycin ב הידרוליזה של פפטידים מ peptidyl-tRNAs, ומקדם דיסוציאציה של מינים אלה מן הריבוזומים. Puromycin התייחסו דגימות (PM) חוסר שיתוף purifyinג'מינים tRNA, וכך לייצג הריבוזומים טהור לחלוטין. כפי שדווח בעבר 8, ריבוזומים האלה הם שלמים מאוד פעיל ביוכימית, מה שהופך אותם מצעים אידיאלי עבור ניתוחים תפקודית מבנית מפורט.
באיור 1. תרשים זרימה שיטה. לטיהור chromatographic של הריבוזומים באמצעות ציסטאין המקושרים sulfolink שרף מתואר.
באיור 2. ניתוח נציג ההכנות הריבוזום. סך מינים היו RNA המופק lysates תא הכולל (T), Sulfolink הריבוזומים מטוהרים (SL) ו Sulfolink מטוהרים הריבוזומים מטופלים לאחר מכן עם puromycin ו משקעים באמצעות כרית גליצרול (PM). ליין M מייצג סמנים RNA גודל. להקות ייצוג rRNAs 25s ו 18S, כמו גם tRNAs ושאר מינים RNA מצוינים. כלסמטאות עמוסות 2 מיקרוגרם של רנ"א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקולים טיהור ריבוזום בעצם כרוך תאים lysing, קצירת חלק מן cytosolic ספין במהירות נמוכה ולאחר מכן pelleting הריבוזומים על ידי צנטריפוגה מהירות גבוהה 1. בעוד כמה שיטות הרומן שימשו לטיהור הריבוזומים חיידקי, אותו לא היה נכון לגבי אאוקריוטים 2-4. למרות צעדים נוספים נוספו לאורך שנים, רוחץ מלח למשל, וכריות גליצרול (למשל לראות 5), מחקרים ביוכימיים ומבניים של הריבוזומים שמרים כבר הקשו על ידי נטייתם להיות מושפל על ידי אנזימים משפיל אנדוגני במהלך תהליך טיהור, סביר להניח עקב תקופות ארוכות במהלך השלבים ultracentrifugation שבמהלכו הריבוזומים נחשפים אלה כיתות של אנזימים 6.
הבעיה העיקרית הקשורה פרוטוקולים המסורתית היא שיתוף טיהור של פרוטאזות ו nucleases עם ריבוזומים. התוצאה היא השפלה שלהם במהלךאת תהליך הטיהור, וכתוצאה מכך התשואות נמוך יותר של הריבוזומים פעיל ביוכימית. רמות גבוהות של פרוטאזות ו nucleases נוכח קליני מבודד של חיידקים פתוגניים הובילו לפיתוח שיטה chromatographic לטיהור הריבוזום באמצעות ציסטאין טעונה Sulfolink שרף 7. RRNAs וחלבונים שמקורם הריבוזומים חיידקים בודדים בשיטה זו הראו רמות נמוכות יותר של השפלה, ואת הריבוזומים מטוהרים כך היו באופן משמעותי יותר מסוגלת לאגד אריתרומיצין ו לסנתז חלבונים. הכימיה ספציפיים של הריבוזום מחייב את שרף Sulfolink אינו ידוע, אולם זה כבר העריכו כי מדובר אינטראקציות הידרופוביות 7. תצפיות אלו הציע ציסטאין טעונה Sulfolink שיטת כרומטוגרפיה שרף יכול להיות גם ישים הריבוזומים שמרים, ואם כן, כי זה יכול לפתור רבות מהבעיות המתוארות לעיל. לכן התאמנו את זה בפרוטוקול לבידוד של ribo, שלם שמרים מאוד פעילsomes. Chromatographic טור שיטה במהירות וביעילות תוצאות ההפרדה של חלק משמעותי של זיהום nucleases ו פרוטאזות של הריבוזומים וכתוצאה מכך טהורה יותר, ההכנות יותר הריבוזום פעיל ביוכימית עם תכונות ביוכימיות מבנית משופרת, אשר קשקשים גם כמויות גבוהות של הריבוזומים 8. הבדלים משמעותיים נראו על ג'ל חלבון denaturing בין מסורתי הריבוזומים מטוהרים אלה מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה בעמודה, המציין כי הריבוזומים אלה מכילים את כל האלמנטים ריבוזומלי כמו הריבוזומים מטוהרים מסורתי.
יש כמה צעדים בפרוטוקול הדורשים תשומת לב מיוחדת. לגבי שיבוש של תאים שמרים, יחס מדויק של 1:01 ההשעיה התא חרוזי זכוכית (כרך / כרך) היא קריטית. בדרך כלל, ~ 80% של תאים הם שיבשו תוך 2 דקות. חשוב לציין, מעל שיבוש יש להימנע כדי למנוע את שחרורו של אנזימים משפיל מן האברונים בתא.למרות הריבוזומים התקבלו ישירות בעמודה Sulfolink הוצגו להיות כמעט חופשי לחלוטין של זיהום פרוטאז ו nuclease, התצפית של רמות גבוהות של tRNA בשבריר זה ציינו כי שרף נקשר tRNA וגם 7,8. מצאנו כי נוכחות של מינים tRNA מפריע מבחני ביוכימיים במורד למשל מחייב הריבוזום / ליגנד, מבחני פעילות peptidyltransferase ומנתח rRNA מבניים. Puromycin טיפול 9 של chromatographically תוצאות הריבוזומים מבודדים ייצור peptidyl-puromycin, אשר שוחרר מבית הריבוזומים, יחד עם tRNAs deacylated 10-14. צנטריפוגה הסופי לילה במהירות גבוהה של דגימות באמצעות כרית גליצרול הוא קריטי עבור הסרת tRNAs חינם הנותר מן דגימות הריבוזום. אם יחידות משנה נפרדות נדרשים, הם יכולים להשיג על ידי השקעה באמצעות שיפוע סוכרוז גבוהה מלח 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לכל חברי המעבדה Dinman, כולל אשטון Belew, קארן ג'ק, Sharmishtha Musalga, סרגיי Sulima, Shivani Reddy, מיכאל רודין על עזרתם קלט על הפרויקט הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AM מן איגוד הלב האמריקני (AHA 0630163N) ו JDD מן המכונים הלאומיים לבריאות (5R01 GM058859-12). ג'אל נתמכה על ידי מהשקעה Recovery Act האמריקאי תוספת של 2009 כדי להעניק את ההורה (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).
