Summary
Contaminazione di preparati di ribosomi eucarioti purificata con metodi tradizionali da parte di co-purificazione nucleasi e proteasi influisce negativamente sulla valle analisi biochimiche e strutturali. Un metodo rapido e semplice purificazione cromatografica viene utilizzato per risolvere questo problema utilizzando ribosomi lievito come sistema modello.
Abstract
Ribosomi eucariotici sono molto più labili rispetto alle loro controparti eubatteri e archael, ponendo così una sfida significativa per i ricercatori. Particolarmente fastidioso è il fatto che la lisi delle cellule rilascia un gran numero di proteasi e nucleasi che può degradare i ribosomi. Quindi, è importante separare i ribosomi di questi enzimi nel più breve tempo possibile. Purtroppo, i metodi convenzionali ultracentrifugazione differenziale lascia ribosomi esposti a questi enzimi per periodi troppo lunghi di tempo, che influiscono sulla loro integrità strutturale e la funzionalità. Per risolvere questo problema, utilizziamo un metodo cromatografico utilizzando una cisteina carica Sulfolink resina. Questa applicazione semplice e rapida riduce in modo significativo le attività di co-purificazione proteolitici e nucleolytic, producendo rendimenti elevati di intatto, ribosomi lieviti altamente biochimicamente attivi. Suggeriamo che questo metodo dovrebbe essere applicabile anche ai ribosomi dei mammiferi. La semplicità diil metodo, e la purezza maggiore e l'attività del ribosoma cromatograficamente purificato rappresenta un progresso tecnico significativo per lo studio dei ribosomi eucarioti.
Protocol
1. Preparazione di un cisteina carica Sulfolink resina
- Preparare Sulfolink resina (Pierce) a temperatura ambiente.
- Posizionare un totale di 10 ml di una emulsione al 50% di gel di accoppiamento Sulfolink come fornito dal produttore in due flaconcini da 10 ml in plastica, con 5 ml distribuito in ciascuna provetta.
- Centrifugare brevemente fiale a 850 xg e rimuovere con attenzione surnatanti.
- Lavare il gel tre volte in un tampone di accoppiamento (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) da risospendere le perle in 5 ml, centrifugazione a 850 xg brevemente e rimuovere il surnatante tramite pipetta.
- Aggiungere cinque ml di una soluzione 50 mM di L-cisteina in un tampone di accoppiamento a ciascuna provetta e miscelare l'impasto per 1 ora a 25 ° C.
- Rimuovere il residuo di L-cisteina con il lavaggio come descritto al punto 1.4.
- Risospendere il gel in 10 ml di tampone vincolante [20 HEPES mM, pH 7,6, 5 mM Mg (OAC) 2, 60 mM di NH 4 Cl, 2 mM DTT] ed equilibrare la resina con il lavaggio in 10 ml di tampone vincolante3 volte come descritto al punto 1.4. Resina decantare in una centrifuga da 10 ml colonna, calotta e conservati a 4 ° C. La capacità di resina per l'RNA legame è ~ 20 A 260 unità per ml.
2. Purificazione cromatografica dei ribosomi con una cisteina carica Sulfolink resina
Nota: Se si lavora con un ceppo dove l'attività della proteasi si rivela essere un problema, cocktail inibizione della proteasi può essere utilizzato in tutti i buffer successive.
- Mantenere tutti i componenti su ghiaccio e preparare tutte le soluzioni con RNase-free acqua e filtrazione sterile.
- Crescere cellule di lievito durante la notte a metà fase di log (OD 595 = 0,6-1,2) nelle matrici appropriate. Celle a pellet per centrifugazione, e lavare 1 grammo cellule in un tampone di legame e centrifugare a 3700 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 1 ml di tampone legame con un volume totale approssimativo di 2 ml, e di interrompere con un uguale volume di perle di mm 0,5 di vetro refrigerate a 4 ° C ucantare una Biospec Mini-tallone battitore (Bartlesville, OK). I campioni possono essere suddivisi in tubi multipli, se necessario.
- Rimuovere le cellule ininterrotta, organelli e detriti cellulari mediante centrifugazione a 30.000 xg per 30 minuti in un Beckman-Coulter ultracentrifuga Optima Max E (Fullerton, CA).
- Immediatamente prima dell'uso, pellet la resina per un minuto a 1.000 xg per rimuovere la soluzione di storage. Due ml di resina viene utilizzato per ogni grammo di cellule.
- Rimuovere surnatanti lisato cellulare dallo spin 30.000 xg (S30), avendo cura di minimizzare la contaminazione sia dalla frazione lipidica in cima o detriti cellulari alla base dei tubi, e posto direttamente nel liquame Sulfolink carica. Lo strato lipidico possono essere evitati o per la rimozione o spingendo fuori dalla pipetta dopo che la punta ha attraversato nel surnatante.
- Incubare la miscela S30/Sulfolink sul ghiaccio senza mescolare per 15 minuti.
- Posizionare le colonne in provette da 15 ml e centrifugare a 1000 xg perr un minuto.
- Posizionare le frazioni eluato nuovamente dentro le colonne, mescolare a mano, e incubare per altri 15 minuti in ghiaccio.
- Posizionare le colonne in provette da 15 ml e centrifugare a 1000 xg per un minuto. Eliminare l'eluato.
- Colonne tappo e aggiungere 5 ml di tampone vincolanti. Mescolare le colonne a mano fino risospeso, rimuovere i tappi, e centrifugare la centrifuga colonne a 1.000 xg per un minuto. Ripetere questo protocollo di lavaggio altre due volte.
- Aggiungere 1,5 ml di tampone di eluizione (20 mM HEPES-KOH a pH 7,6, 10 mM Mg (OAC) 2, 500 mM KCl, 2mM DTT, 0,5 mg / ml di eparina) per ogni colonna. Mescolare impasti a mano, e incubare in ghiaccio per 2 minuti
- Colonne posto in nuove provette da 15 ml e centrifugare a 1000 xg per 1 minuto. Raccogliere eluato. Ripetere il passaggio di eluizione una volta di più che il volume finale del campione combinato sono circa 3 ml. Resina utilizzata può essere lavata con tampone di eluizione senza eparina seguita da equilibrio con buffe vincolanter, e conservati in volumi di 10 ml di tampone vincolante a 4 ° C per il riutilizzo in seguito.
3. Puromicina trattamento
Nota: Un metodo alternativo per rimuovere contaminanti specie di tRNA è quello di passare da una ricca glucosio glucosio impoverito ai media per promuovere il deflusso ribosoma. Tuttavia, questo non cambia lo stato metabolico delle cellule di lievito, che potrebbero influenzare la funzione dei ribosomi e la concentrazione.
Al fine di spogliare i ribosomi da endogene peptidil-tRNA, un trattamento viene eseguito con puromicina.
- Neutralizzare al pH 7.5 100 mM puromicina soluzione con l'aggiunta di KOH 1M goccia a goccia a temperatura ambiente.
- Aggiungere la soluzione puromicina neutralizzata a concentrazione finale di 1 mM ~ eluato.
- Aggiungere 100 mM GTP ad una concentrazione finale di 1 mm.
- Incubare per 30 minuti a 30 ° C.
4. Purificazione dei ribosomi per sedimentazione attraverso cuscini glicerolo
- Mettere un mldi tampone cuscino (20 HEPES mM, pH 7,6, 10 mM Mg (OAC) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 25% glicerolo) in un tubo 4 volumi ultracentrifuga ml in policarbonato.
- Delicatamente strato puromicina trattati frazioni di eluizione in cima al cuscino, e campioni di centrifugare a 100.000 xg notte a 4 ° C.
- Rimuovere i tubi dal rotore centrifuga, ed aspirare surnatanti.
- Lavare pellet contenenti ribosomi purificati due volte con 1 ml di tampone cuscino.
- Risospendere ribosomi in 100 ml di tampone cuscino dalla rottura dolce utilizzando una bacchetta di vetro.
- Dopo la rottura, coprire i tubi con parafilm e agitare ad una velocità moderata in un vortice stanza fredda per un'ora.
- Trasferire il contenuto in una provetta, centrifugare per 5 minuti a velocità massima a 4 ° C, e rimuovere surnatanti ai tubi fresca.
- Ripetere i passaggi 4,1-4,7 con 2 ml di tampone cuscino e, tranne che 100 microlitri di buffer di memorizzazione (50 mM HEPES-KOH a pH 7,6, 50 mM di NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAC) 2, 1 mM DTT, 25% glicerolo) è usato in passi 4.4 e 4.5 invece di buffer di cuscino.
- Quantificare i ribosomi purificati spettrofotometricamente (1 A 260 = 20 pmoli dei ribosomi lievito), e conservare a -80 ° C. I risultati tipici da 1 grammo di lievito sono 300-400 pmoli dei ribosomi.
5. Rappresentante dei risultati:
Un esempio di specie di RNA estratto da ciascuna delle tre fasi principali del protocollo è mostrato nella Figura 2. Mentre rRNA sono le specie principali presenti in lisati cellulari totali (T) anche questi contengono un gran numero di altre specie di RNA. Ribosomi purificati dalla colonna Sulfolink (SL) contengono anche una grande quantità di tRNA a causa della elevata affinità del letto della colonna per queste specie. Il trattamento di questa frazione con risultati puromicina in idrolisi di peptidi da peptidil-tRNA, e promuove la dissociazione di queste specie da ribosomi. Il puromicina trattati campioni (Pm) la mancanza di co-purifying specie di tRNA, ribosomi e rappresentano quindi completamente puro. Come riportato in precedenza 8, dette ribosomi sono altamente intatti e biochimicamente attive, che li rende ideali per substrati dettagliate analisi funzionali e strutturali.
Figura 1. Diagramma di flusso metodo. Purificazione cromatografica dei ribosomi con il cisteina legate sulfolink resina è raffigurato.
Figura 2. Analisi rappresentante di preparati ribosoma. Totale specie di RNA sono stati estratti da lisati cellulari totali (T), Sulfolink ribosomi purificati (SL) e Sulfolink purificata ribosomi successivamente trattati con puromicina e sedimentate attraverso un cuscino glicerolo (Pm). Corsia M rappresenta segnataglie RNA. Bande che rappresentano rRNA 25S e 18S, così come tRNA e altre specie di RNA sono indicati. Tutticorsie sono stati caricati con 2 mg di RNA.
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Discussion
Protocolli di purificazione ribosoma fondamentalmente coinvolgere le cellule di lisi, raccolta una frazione citosolica da un testacoda a bassa velocità, e poi cubettatura ribosomi tramite centrifugazione ad alta velocità 1. Mentre un paio di nuovi metodi sono stati utilizzati per purificare i ribosomi batterici, lo stesso non fosse stato vero per eucarioti 2-4. Anche se ulteriori passi sono stati aggiunti nel corso degli anni, si lava sale ad esempio, e cuscini glicerolo (ad esempio vedi 5), studi biochimici e strutturali dei ribosomi lievito sono stati ostacolati dai loro tendenza ad essere degradato da enzimi degradanti endogeni durante il processo di purificazione, molto probabilmente a causa del lungo periodo di tempo durante le fasi ultracentrifugazione durante il quale sono esposti i ribosomi a queste classi di enzimi 6.
Il problema principale associato con protocolli tradizionali è il co-purificazione della proteasi e nucleasi con ribosomi. Ciò si traduce nella loro degradazione duranteil processo di depurazione, con conseguente calo dei rendimenti dei ribosomi biochimicamente attivi. Gli alti livelli di proteasi e nucleasi presenti in isolati clinici di batteri patogeni ha portato allo sviluppo di un metodo cromatografico per la purificazione ribosoma con un cisteina carica Sulfolink resina 7. L'rRNA e proteine derivate da ribosomi batterici isolati con questo metodo hanno mostrato livelli molto più bassi di degrado, e la ribosomi così purificato erano significativamente più in grado di legarsi eritromicina e di sintetizzare proteine. La chimica specifica di legame al ribosoma resina Sulfolink è sconosciuto, tuttavia è stato ipotizzato che si tratta di interazioni idrofobiche 7. Queste osservazioni suggerito che la cisteina carica Sulfolink metodo di cromatografia in resina può essere applicata anche ai ribosomi di lievito, e se sì, che potrebbe risolvere molti dei problemi sopra descritti. Così abbiamo adattato questo protocollo per l'isolamento di intatto, ribo lieviti altamente attivaSomes. Il metodo cromatografico colonna rapidamente ed efficacemente i risultati nella separazione di una frazione significativa di contaminazione nucleasi e proteasi da ribosomi con conseguente più pura, più preparati biochimicamente attivi ribosoma con migliori proprietà biochimiche e strutturali, che scala ben superiore alla quantità di ribosomi 8. Nessuna differenza significativa è stata vista su un gel denaturante proteico tra tradizionalmente ribosomi purificati e quelli purificata tramite cromatografia su colonna, indicando che questi ribosomi contengono tutti gli stessi elementi ribosomiale come ribosomi tradizionalmente purificato.
Ci sono alcuni passaggi in protocollo che richiedono particolare attenzione. Per quanto riguarda la rottura delle cellule di lievito, un preciso rapporto 1:1 di sospensione cellulare in perline di vetro (vol / vol) è critica. Tipicamente, ~ 80% delle cellule sono interrotti in 2 min. Importante, troppo disturbo deve essere evitato per prevenire il rilascio di enzimi degradanti da organelli cellulari.Anche se i ribosomi ottenuto direttamente dalla colonna Sulfolink hanno dimostrato di essere quasi completamente privo di contaminazione della proteasi e nucleasi, l'osservazione di elevati livelli di tRNA in questa frazione ha indicato che la resina si lega tRNA e 7,8. Abbiamo scoperto che la presenza di specie di tRNA interferisce con la valle saggi biochimici per esempio vincolante ribosoma / ligando, saggi di attività peptidyltransferase rRNA e analisi strutturale. Puromicina trattamento 9 di cromatograficamente risultati ribosomi isolati nella produzione di peptidil-puromicina, che viene rilasciato da ribosomi, insieme con tRNA deacylated 10-14. La finale centrifugazione ad alta velocità durante la notte dei campioni attraverso un cuscino glicerolo è un fattore critico per la rimozione del tRNA rimanente libero dai campioni ribosoma. Se subunità sono tenuti separati, possono essere ottenuti per sedimentazione attraverso un alto gradiente di saccarosio sale 15
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare tutti i membri del laboratorio Dinman, tra Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, e Michael Rhodin per il loro aiuto e l'ingresso su questo progetto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni a AM dalla American Heart Association (AHA 0630163N) e JDD dal National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL è stata sostenuta da un reinvestimento americano e Recovery Act del 2009, supplemento alla concessione genitore (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
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