Summary
CO浄化ヌクレアーゼ及びプロテアーゼによって従来の方法で精製した真核生物リボソームの調製品の汚染は否定的に下流の生化学的および構造解析に影響を与えます。迅速かつ簡単なクロマトグラフィー精製法は、モデル系として、酵母のリボソームを使用してこの問題を解決するために使用されます。
Abstract
真核生物のリボソームは、このように研究者に大きな課題を投げかけ、はるかに不安定な彼らの真正細菌とarchaelの対応と比較しています。特に厄介な細胞の溶解は、リボソームを低下させる可能性プロテアーゼおよびヌクレアーゼの多数のリリースという事実です。従って、それは可能な限り迅速にこれらの酵素からリボソームを分離することが重要です。残念ながら、従来の差動遠心分離法は、それらの構造的完全性と機能性に影響を与える、時間の許容できないほど長時間、これらの酵素にさらされるリボソームを残します。この問題に対処するため、我々はSulfolink樹脂充電システインを使用してクロマトグラフィー法を利用しています。このシンプルかつ迅速なアプリケーションが大幅にそのまま、非常に生化学的にアクティブ酵母のリボソームの高収量の生産、CO浄化のタンパク質分解と核酸分解活性を低減します。我々は、このメソッドはまた、哺乳動物リボソームに適用されるべきことを示唆している。のシンプルさクロマトグラフィーで精製したリボソームの方法、および強化された純度と活性は、真核生物のリボソームの研究のための重要な技術的進歩を表しています。
Protocol
1。 Sulfolink樹脂の帯電システインの準備
- 室温でSulfolink樹脂（Pierce）を準備します。
- 各バイアルに分散5mlで、として2 10ミリリットルのプラスチックバイアルの製造元によって提供されるSulfolinkカップリングゲルの50％のスラリーを10mlの合計を置きます。
- 簡単に言えば850 × gでバイアルを遠心し、注意深く上清を取り除く。
- 、5mlにビーズを再懸濁XGの850℃を軽く遠心し、ピペットで上清を除去することにより（50 mMトリス、pH 8.5、5mMのEDTA）カップリングバッファーでゲル3回洗浄する。
- 各チューブにカップリング緩衝液中のL -システインの50 mM溶液五mlを加え、25℃で1時間スラリーを混合℃に
- 上記のステップ1.4で説明したように洗浄することにより残存L -システインを削除します。
- 結合緩衝液10mlでゲル[20mMのHEPES、pHは7.6、5 mMのマグネシウム（OAC）2、60mMのNH 4 Clを 、2mMのDTT]を再懸濁し、そして結合緩衝液10mlで洗浄することによって樹脂を平衡化3回は、ステップ1.4で説明したように。デカント10 mlの遠心カラムへの樹脂、キャップと4℃で保存RNA結合用樹脂の能力は〜20ミリリットル当たり260単位です。
2。 Sulfolink樹脂の帯電システインを使用して、リボソームのクロマトグラフィー精製
注：プロテアーゼ活性が問題であると証明する菌株を扱う場合、プロテアーゼ阻害カクテルは、後続のすべてのバッファで使用することができます。
- 氷の上ですべてのコンポーネントを維持し、RNaseフリー水、無菌ろ過を使用して、すべてのソリューションを準備する。
- 適切なメディアで-中期対数増殖期（1.2 OD 595 = 0.6）に一夜酵母細胞を成長する。ペレットを遠心分離により細胞、および4℃で5分間3700 × gで結合バッファーと遠心で1グラムの細胞を洗浄℃に
- 結合緩衝液1mlで2 mlのおおよその合計量に対して、および4に冷やして0.5 mmのガラスビーズの等量を使用して混乱させる再懸濁し、細胞° C UBiospecミニビーズビーター（バートル、[OK]を）歌う。必要に応じてサンプルは複数のチューブに分割することができます。
- Beckman - Coulter社オプティママックスEの超遠心機（フラートン、カリフォルニア州）で30分間、30,000 xgで遠心分離によって破砕されなかった細胞、オルガネラ、および細胞の残骸を削除します。
- 使用直前に、ペレットは1,000で1分間樹脂は、ストレージソリューションを削除するには、XGの。樹脂の二mlの細胞のすべての1グラムのために使用されます。
- 直接充電Sulfolinkスラリー中に非常に上部または細胞残渣管の下部にある脂質画分のいずれかからの汚染、および場所を最小限に抑えるように注意しながら、30,000 × gでのスピン（S30）から細胞ライセートの上清を取り除く。脂質層を除去したり、先端が上清中に交差した後、ピペットから押し出すことで回避できます。
- 15分間混合することなく氷上にS30/Sulfolinkの混合物をインキュベートする。
- 15 mlコニカルチューブにカラムを配置し、1,000 × gで遠心分離R 1分。
- バック列を、手で混合し、氷上でさらに15分間インキュベートにフロースルー画分を置きます。
- 15 mlコニカルチューブにカラムを置き、1分間1,000 × gで遠心。ろ過液を廃棄します。
- キャップの列と結合バッファー5 mlを加える。再懸濁し、キャップを外して、そして1分間1,000 × gでのカラムの遠心機を遠心分離するまで、手で列を混在させること。この洗浄プロトコルをあと2回繰り返します。
- 各カラムに溶出バッファーを1.5 ml（20 mMのHEPES - KOH、pHは7.6、10mMのマグネシウム（OAC）2、500mMのKClを、2mMのDTT、0.5 mg / mlのヘパリン）を追加します。手でスラリーを混合し、氷上で2分間インキュベート
- 1分間1,000 × gで新しい15 mlコニカルチューブと遠心分離機に入れます列。溶出液を集める。もう一度最終的な混合サンプルのボリュームが〜3ミリリットルであることを溶出ステップを繰り返します。使用される樹脂は、ヘパリンなしで溶出緩衝液で洗浄し、結合buffeで平衡化を続けることができますR、および後で再利用するため4で結合バッファー10 mlのボリューム° Cに保存。
3。ピューロマイシンの治療
注：代替方法汚染のtRNA種を除去するためには、メディアがリボソーム流出を促進するために枯渇グルコースへの豊富なグルコースから切り替えることです。しかし、これはリボソームの機能と濃度に影響を与える可能性の酵母細胞の代謝状態を変更しません。
内因性ペプチジル- tRNAのからリボソームを除去するために、ピューロマイシンによる治療が行われます。
- 室温で1M KOH滴下してpH7.5の100mMのピューロマイシンのソリューションに中和する。
- 溶出液中の〜1mMの最終濃度になるように中和ピューロマイシン溶液を加える。
- 1mMの最終濃度を100 mMのGTPを追加。
- 30℃で30分間インキュベート℃、
4。グリセロールのクッションを介して沈降によるリボソームの精製
- 場所1ミリリットルクッションの緩衝液（20mM HEPES、pHは7.6、10mMのマグネシウム（OAC）2、500mMの塩化カリウム、2mMのDTT、25％グリセロール）の4 mlの容積ポリカーボネート超遠心チューブに。
- 一晩4 XGの100,000クッションの上に溶出分画、及び遠心分離サンプルを扱う優しく層ピューロ℃に
- 遠心ローターからチューブを外し、上清を吸引除去する。
- クッション緩衝液1mlで2回精製リボソームを含むペレットを洗う。
- ガラス棒を使用して穏やかな破壊によってクッションバッファー100μlでリボソームを再懸濁します。
- 中断した後、パラフィルムでチューブをカバーし、一時間低温室の渦の中程度のスピードで振る。
- 、マイクロ遠心チューブに内容を移し、4℃での最大速度で5分間遠心し、そして新鮮なチューブに上清を取り除く。
- 2クッションの緩衝mlのと、保存緩衝液（50mMのHEPES - KOH pHは7.6、50mMのNH 4 Clを、5mMのMgのその100μlを除いてを使用して、ステップ4.1から4.7を繰り返します。（OAC）2、1mMのDTT、25％グリセロール）が代わりにクッションのバッファのステップ4.4および4.5で使用されています。
- 定量精製リボソーム分光光度法（1 A 260 = 20酵母のリボソームのピコモル）、-80℃で保存します。酵母の1グラムの標準的な結果は、リボソームの300〜400ピコモルです。
5。代表的な結果：
プロトコルの3つの主要ステップのそれぞれから抽出したRNA種の例を図2に示されています。 rRNAsは、これらはまた、他のRNA種の多数を含む全細胞ライセート（T）内に存在する主要な種である一方。 Sulfolink列（SL）から精製されたリボソームはまた、同様にこれらの種のカラムベッドの高い親和性によるtRNAの大量が含まれています。ペプチジル- tRNAのからのペプチドの加水分解におけるピューロマイシンの結果、この画分の治療、およびリボソームからこれらの種の解離を促進する。ピューロマイシン処理した試料（PM）の欠如共同purifyinこのようにグラムのtRNA種、および完全に純粋なリボソームを表す。以前に8を報告したように、これらのリボソームは、それらの詳細な機能と構造解析のための理想的な基板製造、無傷および生化学的にアクティブになります。
図1。方法のフローチャート。sulfolinkの樹脂が描かれているリンクされたシステインを使用して、リボソームのクロマトグラフィー精製。
図2。リボソームの調製の代表的な分析全 RNA種が続いてピューロマイシンによる治療を受けた全細胞ライセート（T）、Sulfolink精製リボソーム（SL）とSulfolink精製がリボソームから抽出され、グリセロールのクッション（PM）を介して沈降させた。レーンMはRNAサイズマーカーを表します。 25Sと18S rRNAs、同様のtRNAおよび他のRNA種を表すバンドが示されている。すべてレーンは、RNAを2μgを充填した。
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Discussion
リボソームの精製プロトコルは基本的に低速のスピンからサ イトゾル画分を収穫し、溶解細胞が関与し、高速遠心分離1によってリボソームをペレット化。いくつかの新規な方法は細菌のリボソームを精製するのに使用されているが、同じことが真核生物2〜4真されていませんでした。追加の手順が長年、例えば塩の洗浄、およびグリセロールのクッション（例えば5を参照）に沿って追加されているが、酵母のリボソームの生化学的および構造的研究は、おそらく、精製の 過程で内因性の分解酵素によって分解さになるために彼らの傾向によって妨げられているリボソーム、酵素6のこれらのクラスにさらされている時に超遠心分離工程の間、長期間に起因する。
従来のプロトコルに関連付けられている主要な問題は、リボソームとプロテアーゼおよびヌクレアーゼの共精製です。それらの分解におけるこの結果の間に生化学的にアクティブなリボソームの利回りの低下、その結果精製プロセス、。 Sulfolink樹脂7を充電システインを使用してリボソーム精製用クロマトグラフィー法の開発につながった病原性細菌の臨床分離株に存在するプロテアーゼおよびヌクレアーゼの高レベル。このメソッドを使用して単離された細菌リボソームから派生rRNAsと蛋白質は劣化の非常に低いレベルを示し、その精製されたリボソームは、かなり多くのエリスロマイシンをバインドするとタンパク質を合成することができた。 Sulfolink樹脂へのリボソーム結合の特定の化学的性質は、しかし、それが7を疎水性相互作用を伴うことが推測されている、不明です。これらの観察は、Sulfolink樹脂クロマトグラフィー法充電システインはまた、上述の問題の多くを解決できることを、酵母のリボソームへの適用、そしてもしそうなら可能性があることを示唆した。したがって、我々はそのまま、高活性酵母リボの単離のためにこのプロトコルを適応サムス。迅速かつ効率的に純粋で、その結果リボソーム、スケールだけでなくリボソーム8のより高い量に強化された生化学的および構造的特性、と多くの生化学的活性リボソーム調製物からヌクレアーゼやプロテアーゼを汚染のかなりの部分の分離の結果カラムクロマトグラフィー法。有意差はこれらのリボソームは、伝統的に精製されたリボソームと同じすべてのリボソームの要素を含んでいることを示し、伝統的に精製されたリボソームとカラムクロマトグラフィーにより精製し、それらの間に変性蛋白質のゲルには見られなかった。
特別な注意を必要とするプロトコルのいくつかのステップがあります。酵母細胞の崩壊に関しては、ガラスビーズに細胞懸濁液の正確な1:1の比率（体積/体積）が重要です。通常は、細胞の約80％が2分に中断されます。重要なのは、過剰破壊は細胞小器官からの分解酵素の放出を防止するために避けるべきである。Sulfolinkの列から直接取得したリボソームがプロテアーゼおよびヌクレアーゼ汚染のほぼ完全に自由であることが示されたが、この画分中のtRNAの高いレベルの観察は、樹脂が同様に7,8のtRNAを結合することを示した。私たちは、下流の生化学的アッセイは、リボソーム/リガンド結合、peptidyltransferase活動のアッセイおよびrRNAの構造解析を例とtRNAの種の存在が干渉することを発見した。ピューロマイシン脱アシル化tRNAを10から14と一緒にリボソームから放出されるペプチジル-ピューロマイシン、、の製造におけるクロマトグラフィーで分離されたリボソームの結果の治療9。グリセロールのクッションを介してサンプルの最後の晩高速遠心分離では、リボソームのサンプルから、残りの空きtRNAを除去するために重要です。別のサブユニットが必要な場合は、それらは高い塩のスクロース勾配15を介して沈殿することにより得ることができる
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々はこのプロジェクトで彼らの助けと入力用のアシュトンブリュー、カレンジャック、Sharmishtha Musalga、セルゲイSulima、シヴァーニレディ、そしてマイケルRhodin含むDinmanの研究室のメンバーのすべてを、感謝します。この作品は、米国心臓協会（AHA 0630163N）からAMにと国立衛生研究所（5R01 GM058859 - 12）からしてくれたための補助金によって支えられている。 JALは、親の助成金から2009サプリメントのアメリカの再投資および回復法（3R01GM058859 - 11S1）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
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