Summary
Forurensning av preparater av eukaryote ribosomer renset ved tradisjonelle metoder ved co-rense nukleaser og proteaser påvirker negativt på nedstrøms biokjemiske og strukturelle analyser. En rask og enkel kromatografisk rensing metoden brukes til å løse dette problemet ved hjelp av gjær ribosomer som modell system.
Abstract
Eukaryote ribosomer er mye mer labil i forhold til deres eubacterial og archael kolleger, og dermed utgjør en betydelig utfordring for forskere. Spesielt problematisk er det faktum at lysis av celler utgivelser et stort antall av proteaser og nukleaser som kan redusere ribosomer. Derfor er det viktig å skille ribosomer fra disse enzymene så raskt som mulig. Dessverre forlater konvensjonelle differensial ultracentrifugation metoder ribosomer utsatt for disse enzymene for uakseptabelt lang tid, påvirker deres strukturelle integritet og funksjonalitet. For å løse dette problemet, benytter vi en kromatografisk metode ved hjelp av en cystein ladet Sulfolink harpiks. Denne enkle og raske søknad reduserer co-rensende proteolytiske og nucleolytic aktiviteter, produsere høy avkastning av intakte, svært biokjemisk aktiv gjær ribosomer. Vi foreslår at denne metoden også bør gjelde for pattedyr ribosomer. Enkelheten avmetoden, og den forbedrede renhet og aktivitet av kromatografisk renset ribosomet representerer en betydelig teknisk fremskritt for studier av eukaryote ribosomer.
Protocol
1. Utarbeidelse av cystein ladet Sulfolink resin
- Forbered Sulfolink resin (Pierce) ved romtemperatur.
- Plasser totalt 10 ml av en 50% slurry av Sulfolink kopling gel som leveres av produsenten i to 10 ml plast hetteglass med 5 ml distribueres i hvert hetteglass.
- Kort sentrifuge ampuller på 850 xg og fjern forsiktig supernatants.
- Vask gel tre ganger i kopling buffer (50 mM Tris, 8,5 pH, 5 mM EDTA) av resuspending perlene i 5 ml, sentrifugering kort på 850 xg og fjerne supernatanten med pipette.
- Legg fem ml av en 50 mM løsning av L-cystein i kopling buffer til hver tube og bland slurry i 1 time ved 25 ° C.
- Fjern gjenværende L-cystein ved vask som beskrevet i trinn 1.4 ovenfor.
- Resuspender gel i 10 ml binding buffer [20 mM HEPES, 7,6 pH, 5 mM Mg (OAc) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM DTT], og likevekt harpiks ved å vaske i 10 ml binding buffer3 ganger som beskrevet i trinn 1.4. Dekanter harpiks i en 10 ml sentrifuge kolonne, cap og lagret ved 4 ° C. Harpiksen kapasitet for RNA-binding er ~ 20 A 260 enheter per ml.
2. Kromatografiske rensing av ribosomer bruke en cystein belastes Sulfolink resin
Merk: Hvis arbeider med en belastning hvor protease aktivitet viser seg å være et problem, kan protease hemming cocktails brukes i alle etterfølgende buffere.
- Vedlikeholde alle komponentene på is og forberede alle løsninger ved hjelp av RNase-fritt vann og sterile filtrering.
- Grow gjærceller natten til midt-log fase (OD 595 = 0.6 til 1.2) i egnede media. Pellet cellene ved sentrifugering, og vask 1 gram celler i binding buffer og sentrifuger ved 3700 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Suspender cellene i 1 ml binding buffer til en tilnærmet samlet volum på 2 ml, og forstyrre bruk av et tilsvarende volum på 0,5 mm glassperler kjøles til 4 ° C usynge en Biospec Mini-perle beater (Bartlesville, OK). Prøver kan bli oppdelt i flere rør etter behov.
- Fjern ubrutt celler, organeller, og cellulære rusk ved sentrifugering på 30 000 xg i 30 minutter i en Beckman-Coulter Optima Max E Ultrasentrifuger (Fullerton, CA).
- Umiddelbart før bruk, pellet harpiksen i ett minutt ved 1000 xg å fjerne lagringsløsning. To ml harpiks er brukt for hvert gram av celler.
- Fjern celle lysate supernatants fra de 30.000 xg spinn (S30), ta vare å minimere forurensning enten fra lipid brøkdel helt på toppen eller cellen rusk på bunnen av rørene, og plasser direkte inn i ladet Sulfolink slurry. Den lipid lag kan unngås enten ved fjerning eller ved å skyve ut fra pipettér etter at spissen har krysset inn i supernatanten.
- Inkuber S30/Sulfolink blandingen på isen uten å blande i 15 minutter.
- Plasser kolonner i 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 1000 xgr ett minutt.
- Plasser flowthrough fraksjonene tilbake i kolonner, bland for hånd, og inkuber i ytterligere 15 minutter på isen.
- Plasser kolonner i 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 1000 xg i ett minutt. Kast flowthrough.
- Cap kolonner og tilsett 5 ml binding buffer. Bland kolonner for hånd til resuspendert, fjerne dekslene, og sentrifuger søylene sentrifuger ved 1000 xg i ett minutt. Gjenta dette vask protokoll to ganger til.
- Legg til 1,5 ml eluering buffer (20 mM HEPES-KOH, 7,6 pH, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2mm DTT, 0,5 mg / ml heparin) til hver kolonne. Bland slam for hånd, og inkuber på is i 2 minutter
- Plasser kolonner i nye 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 1000 xg i 1 minutt. Samle eluatet. Gjenta eluering trinnet en gang slik at det endelige kombinerte prøven volumer er ~ 3 ml. Brukte resin kan vaskes med eluering buffer uten heparin og fulgt av stabilisering med bindende Buffer, og lagres i 10 ml volumer av binding buffer ved 4 ° C for gjenbruk senere.
3. Puromycin behandling
Merk: En alternativ metode for å fjerne forurensende tRNA arter er å bytte fra en glukose rike til glukose utarmet media for å fremme ribosom avrenning. Men dette endrer metabolske status av gjærceller som kan påvirke ribosomet funksjon og konsentrasjon.
For å stripe ribosomene fra endogene peptidyl-tRNA, en behandling med puromycin er utført.
- Nøytralisere til pH 7,5 100 mm puromycin løsning ved å legge 1M KOH dropwise ved romtemperatur.
- Legg nøytralisert puromycin løsning til ~ 1mm endelig konsentrasjon i eluatet.
- Tilsett 100 mM GTP til en endelig konsentrasjon på 1 mm.
- Inkuber i 30 minutter ved 30 ° C.
Fire. Rensing av ribosomer ved sedimentering gjennom glyserol puter
- Plasser en mlav pute buffer (20 mM HEPES, 7,6 pH, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 25% glyserol) til en 4 ml volum polykarbonat Ultrasentrifuger tube.
- Forsiktig lag puromycin behandlet eluering fraksjoner på toppen av puten, og sentrifuger prøvene på 100000 xg over natten ved 4 ° C.
- Fjerne rør fra sentrifugen rotoren, og aspirer supernatants.
- Vask pellets inneholder renset ribosomer to ganger med 1 ml pute buffer.
- Resuspender ribosomer i 100 mL av pute buffer ved milde forstyrrelser med en glasstav.
- Etter avbrudd, dekker rør med Parafilm og rist på et moderat tempo i et kaldt rom vortex i én time.
- Overfør innholdet til en mikrosentrifuge tube, sentrifuger i 5 minutter ved maksimal hastighet ved 4 ° C, og fjerne supernatants til fersk rør.
- Gjenta trinn 04.01 til 04.07 med 2 ml pute buffer, og bortsett fra at 100 mL lagring buffer (50 mM HEPES-KOH 7,6 pH, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAc) 2, er 1 mM DTT, 25% glyserol) som brukes i trinn 4.4 og 4.5 i stedet for pute buffer.
- Tallfeste renset ribosomer spektrofotometrisk (1 A 260 = 20 pmoles av gjær ribosomer), og oppbevar ved -80 ° C. Typiske resultater fra 1 gram gjær er 300-400 pmoles av ribosomer.
5. Representative resultater:
Et eksempel på RNA arter hentet fra hver av de tre viktigste trinnene i protokollen er vist i figur 2. Mens rRNAs er de viktigste artene tilstede i total celle lysates (T) er disse også inneholde et stort antall andre RNA arter. Ribosomer renset fra Sulfolink kolonnen (SL) også inneholder en stor mengde tRNAs grunn av høy affinitet i kolonnen sengen for disse artene også. Behandling av denne fraksjonen med puromycin resultater i hydrolyse av peptider fra peptidyl-tRNAs, og fremmer dissosiasjon av disse artene fra ribosomer. Den puromycin behandlet prøvene (PM) mangler co-purifying tRNA arter, og dermed representerer helt ren ribosomer. Som tidligere rapportert 8, disse ribosomer er svært intakt og biokjemisk aktive, noe som gjør dem ideelle underlag for detaljerte funksjonelle og strukturelle analyser.
Figur 1. Metode Flytskjema. Chromatographic rensing av ribosomer bruke cystein knyttet sulfolink harpiks er avbildet.
Figur 2. Representant analyse av ribosom preparater. Total RNA arter ble ekstrahert fra total celle lysates (T), Sulfolink renset ribosomer (SL) og Sulfolink renset ribosomer deretter behandlet med puromycin og sedimenteres gjennom en glyserol pute (PM). Lane M representerer RNA størrelse markører. Band som representerer 25 år og 18S rRNAs, samt tRNAs og andre RNA arter er indikert. Allebaner var lastet med 2 mikrogram av RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ribosom rensing protokoller i utgangspunktet involvere Lysing celler, høsting en cytosoliske brøkdel av en lav hastighet spinn, og deretter pelletering ribosomer ved høy hastighet sentrifugering 1. Mens noen nye metoder har blitt brukt for rensing av bakterielle ribosomer, hadde det samme vært tilfelle for eukaryoter 2-4. Selv om flere tiltak har blitt lagt langs årene, f.eks salt vasker, og glyserol puter (f.eks se 5), har biokjemiske og strukturelle studier av gjær ribosomer vært hemmet av tendensen deres til å bli degradert av endogene enzymer under renseprosessen, mest sannsynlig grunn av lange perioder i løpet av ultracentrifugation trinn under der ribosomer er utsatt for disse klassene av enzymer 6.
Hovedproblemet forbundet med tradisjonelle protokoller er co-rensing av proteaser og nukleaser med ribosomer. Dette resulterer i nedbrytning sine underen renselsesprosess, som resulterer i lavere avkastning av biokjemisk aktive ribosomer. Den høye nivåer av proteaser og nukleaser stede i kliniske isolater av patogene bakterier førte til utviklingen av en kromatografisk metode for ribosomet rensing ved hjelp av en cystein belastes Sulfolink harpiks 7. Den rRNAs og proteiner avledet fra bakterier ribosomer isolert ved hjelp av denne metoden viste langt lavere nivåer av fornedrelse, og ribosomer så renset var signifikant mer i stand til å binde erytromycin og å syntetisere proteiner. Den spesifikke kjemi ribosom binding til Sulfolink harpiksen er ukjent, men det har vært spekulert i at det innebærer hydrofob interaksjon 7. Disse observasjonene antydet at cystein belastes Sulfolink resin kromatografi Metoden kan også være aktuelt å gjær ribosomer, og hvis så, at det kunne løse mange av problemene som er beskrevet ovenfor. Dermed har vi tilpasset denne protokollen for isolering av intakte, svært aktiv gjær RiboSomes. Kolonnen kromatografiske metoden raskt og effektivt resultat i separasjon av en betydelig andel av forurensende nukleaser og proteaser fra ribosomer som resulterer i renere, mer biokjemisk aktive ribosomet forberedelser med forbedrede biokjemiske og strukturelle egenskaper, som skalerer godt til høyere mengder av ribosomer 8. Ingen signifikante forskjeller ble sett på en denaturering protein gel mellom tradisjonelt renset ribosomer og de renset via kolonnen kromatografi, indikerer at disse ribosomer inneholder alle de samme ribosomal elementene som tradisjonelt renset ribosomer.
Det er noen skritt i protokollen som krever spesiell oppmerksomhet. Med hensyn til forstyrrelse av gjærceller, er en presis 1:1 cellesuspensjon til glassperler (vol / vol) kritisk. Vanligvis er ~ 80% av cellene forstyrres i 2 min. Viktigere, bør over-avbrudd unngås for å hindre utslipp av enzymer fra celleorganeller.Selv ribosomer hentes direkte fra Sulfolink kolonnen ble vist å være nesten helt fri for protease og nukleasefritt forurensning, indikerte observasjon av høye nivåer av tRNA i denne fraksjonen at harpiksen binder tRNA så vel 7,8. Vi har funnet at tilstedeværelsen av tRNA arter forstyrrer nedstrøms biokjemiske analyser f.eks ribosomet / ligand binding, analyser av peptidyltransferase aktivitet og rRNA strukturelle analyser. Puromycin behandling 9 av kromatografisk isolert ribosomer resulterer i produksjon av peptidyl-puromycin, som er løslatt fra ribosomer, sammen med deacylated tRNAs 10-14. Den siste natten høy hastighet sentrifugering av prøver gjennom en glyserol pute er kritisk for å fjerne de gjenværende frie tRNAs fra ribosomet prøvene. Hvis separate subenheter er nødvendig, kan de fås ved sedimentering gjennom en høy salt sukrose gradient 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke alle medlemmene av Dinman laboratoriet, blant annet Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, og Michael Rhodin for deres hjelp og innspill på dette prosjektet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til AM fra American Heart Association (AHA 0630163N) og JDD fra National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL ble støttet av en amerikansk reinvestering og Recovery Act av 2009 supplement til den overordnede stipend (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).
