Summary
Contaminação de preparações dos ribossomos eucarióticos purificado por métodos tradicionais de co purificação de proteases e nucleases negativamente impactos sobre a jusante análises bioquímicas e estruturais. Um método de purificação cromatográfica rápida e simples é usado para resolver esse problema usando os ribossomos de levedura como um sistema modelo.
Abstract
Ribossomos eucarióticos são muito mais instável, em comparação com os seus homólogos eubacterianas archael e, desta forma criando um grande desafio para os pesquisadores. Particularmente problemático é o fato de que a lise de células libera um grande número de proteases e nucleases que podem degradar os ribossomos. Assim, é importante separar os ribossomos a partir destas enzimas o mais rápido possível. Infelizmente, os métodos convencionais ultracentrifugação diferencial deixa ribossomos expostos a estas enzimas por períodos inaceitavelmente longos de tempo, afetando sua integridade estrutural e funcionalidade. Para resolver este problema, nós utilizamos um método de cromatografia usando uma cisteína cobrado Sulfolink resina. Esta aplicação simples e rápido reduz significativamente co purificação de atividades proteolíticas e nucleolytic, produzindo altos rendimentos de intacto, ribossomos de levedura altamente bioquimicamente ativas. Sugerimos que este método também deve ser aplicável a ribossomos de mamíferos. A simplicidade deo método ea pureza maior e atividade do ribossomo purificada cromatograficamente representa um avanço técnico significativo para o estudo dos ribossomos eucarióticos.
Protocol
1. Preparação de uma cisteína cobrado Sulfolink resina
- Prepare Sulfolink resina (Pierce) em temperatura ambiente.
- Lugar um total de 10 ml de uma suspensão de 50% dos Sulfolink gel de acoplamento, conforme fornecido pelo fabricante em dois frascos de 10 ml de plástico, com 5 ml distribuídos em cada frasco.
- Brevemente frascos de centrífuga a 850 xg e remova cuidadosamente sobrenadantes.
- Lave o gel três vezes em tampão de acoplamento (50 mM Tris, pH 8.5, 5 mM EDTA) pela ressuspensão as contas em 5 ml, centrifugação a 850 xg brevemente e remover o sobrenadante com uma pipeta.
- Adicione cinco ml de uma solução 50 mM de L-cisteína em tampão de acoplamento em cada tubo e misture a polpa de 1 hora a 25 ° C.
- Remover o residual L-cisteína por lavagem como descrito no passo 1.4 acima.
- Ressuspender o gel em 10 ml de tampão de ligação [20 mM HEPES, pH 7.6, 5 mM Mg (OAc) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM DTT], e equilibrar a resina pela lavagem em 10 ml de tampão de ligação3 vezes como descrito no passo 1.4. Decantar resina em uma centrífuga de 10 ml coluna tampa, e armazenados a 4 ° C. A capacidade de resina para RNA ligação é ~ 20 A 260 unidades por ml.
2. Purificação cromatográfica dos ribossomos usando uma cisteína cobrado Sulfolink resina
Nota: Se estiver trabalhando com uma cepa em que a atividade protease prova ser um problema, cocktails da inibição da protease pode ser usado em todos os buffers subseqüentes.
- Manter todos os componentes no gelo e preparar todas as soluções usando RNase água e filtração estéril.
- Cultivar células de levedura durante a noite para meados log-fase (OD 595 = 0,6-1,2) em mídia apropriada. Pellet células por centrifugação, e lavar as células 1 grama em tampão de ligação e centrifugar a 3700 xg por 5 minutos a 4 ° C.
- Ressuspender as células em 1 ml de tampão de ligação a um volume total aproximado de 2 ml, e interromper usando um volume igual de 0,5 milímetros contas de vidro refrigerados a 4 ° C ucantar uma Biospec Mini-bead beater (Bartlesville, OK). Amostras podem ser divididos em tubos múltiplos, conforme necessário.
- Remove as células intactas, organelas, e os restos celulares por centrifugação a 30.000 xg por 30 minutos em uma Optima Max Beckman-Coulter ultracentrífuga E (Fullerton, CA).
- Imediatamente antes da utilização, pellet da resina por um minuto a 1.000 xg para remover a solução de armazenamento. Dois ml de resina é usada para cada grama de células.
- Remover sobrenadantes lisado celular a partir do spin-xg 30.000 (S30), tendo o cuidado de minimizar a contaminação tanto da fração lipídica no topo ou os restos de células na parte inferior dos tubos, e coloque diretamente na pasta Sulfolink cobrado. A camada lipídica podem ser evitados tanto por remoção ou empurrando para fora da pipeta após o ponta cruzou para o sobrenadante.
- Incubar a mistura S30/Sulfolink no gelo sem misturar por 15 minutos.
- Coloque as colunas em tubos cônicos de 15 ml e centrifugar a 1000 xg porr de um minuto.
- Coloque as frações fluxo contínuo de volta para as colunas, misture com a mão, e incubar por mais 15 minutos no gelo.
- Coloque as colunas em tubos cônicos de 15 ml e centrifugar a 1000 xg durante um minuto. Descartar o fluxo contínuo.
- Cap colunas e adicionar 5 ml de tampão de ligação. Mix colunas à mão até ressuspenso, remover as tampas, e centrifugar a centrífuga a 1.000 xg colunas durante um minuto. Repita este protocolo de lavagem mais duas vezes.
- Adicionar 1,5 ml de tampão de eluição (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2mM DTT, 0,5 mg / ml de heparina) para cada coluna. Mix de suspensões por mão, e incubar no gelo por 2 minutos
- Colunas lugar em novos tubos de 15 ml cônico e centrifugar a 1000 xg por 1 minuto. Coletar eluído. Repita o passo de eluição mais uma vez para que o final de volumes de amostra são combinados ~ 3 ml. Resina utilizada pode ser lavado com tampão de eluição sem heparina e seguida de equilíbrio com Buffe vinculativor, e armazenados em volumes de 10 ml de tampão de ligação a 4 ° C para reutilização posterior.
3. Tratamento puromicina
Nota: Um método alternativo para remover contaminantes espécies tRNA é mudar a partir de uma glucose ricos em mídia de glicose esgotados para promover o escoamento ribossomo. No entanto, isso muda o estado metabólico das células de levedura, o que poderia afetar a função do ribossomo e concentração.
, A fim de strip os ribossomos a partir endógena peptidil-tRNA, um tratamento com puromicina é executada.
- Neutralize a solução de pH 7,5 puromicina 100 mM KOH 1M, adicionando gota a gota à temperatura ambiente.
- Adicionar solução puromicina neutralizado para ~ concentração 1mM final no eluído.
- Adicionar 100 mM GTP para uma concentração final de 1 mM.
- Incubar por 30 minutos a 30 ° C.
4. Purificação dos ribossomos por sedimentação através de coxins de glicerol
- Coloque um mlalmofada de tampão (20 mM HEPES, pH 7.6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, glicerol 25%) em um tubo de volume 4 ml ultracentrífuga policarbonato.
- Suavemente camada puromicina tratados frações de eluição em cima da almofada, e amostras de centrifugação a 100.000 xg durante a noite a 4 ° C.
- Remover os tubos do rotor de centrífuga, e aspire sobrenadantes.
- Lavar pellets contendo ribossomos purificada duas vezes com 1 ml de tampão almofada.
- Ressuspender ribossomos em 100 l de tampão almofada pela ruptura suave usando uma vareta de vidro.
- Após interrupção, cobrir os tubos com parafilme e agite a uma velocidade moderada em um vórtice sala fria durante uma hora.
- Transferir o conteúdo para um tubo de microcentrífuga, centrífuga por 5 minutos na velocidade máxima a 4 ° C, e remover sobrenadante para tubos fresco.
- Repita os passos de 4,1-4,7 utilizando 2 ml de tampão almofada e, exceto pelo fato de 100 mL de buffer de armazenamento (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAc) 2, 1 mM DTT, glicerol 25%) é usado em passos 4.4 e 4.5 ao invés de tampão almofada.
- Quantificar os ribossomos purificada espectrofotometricamente (1 A 260 = 20 pmoles dos ribossomos de levedura), e armazenar a -80 ° C. Os resultados típicos a partir de 1 grama de levedura são 300-400 pmoles dos ribossomos.
5. Resultados representativos:
Um exemplo de espécies de RNA extraído de cada uma das três etapas principais do protocolo é mostrado na Figura 2. Enquanto rRNAs são as principais espécies presentes em lisados celulares total (T) estes também contêm um grande número de outras espécies de RNA. Ribossomos purificada a partir da coluna Sulfolink (SL) também contêm uma grande quantidade de tRNAs devido à alta afinidade da cama coluna para estas espécies também. Tratamento desta fração com resultados puromicina na hidrólise de peptídeos de peptidil-tRNAs, e promove a dissociação dessas espécies de ribossomos. A puromicina amostras tratadas falta (Pm) co-purifyinespécies g tRNA, e, portanto, representam ribossomos completamente puro. Como relatado anteriormente 8, essas ribossomos são altamente intacta e bioquimicamente ativas, tornando-os ideais para substratos detalhadas análises funcionais e estruturais.
Figura 1. Fluxograma do método. Purificação cromatográfica dos ribossomos usando a cisteína ligados sulfolink resina é retratado.
Figura 2. Análise representativa das preparações ribossomo. Espécies de RNA total foram extraídas de lisados celulares total (T), ribossomos Sulfolink purificada (SL) e Sulfolink purificada ribossomos posteriormente tratados com puromicina e sedimentada através de uma almofada de glicerol (Pm). Pista M representa marcadores de tamanho RNA. Bandas representando rRNAs 25S e 18S, bem como tRNAs e outras espécies de RNA são indicados. Todospistas foram carregados com 2 mg de RNA.
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Discussion
Protocolos de purificação de ribossomo basicamente envolvem as células de lise, colhendo uma fração citosólica de uma rotação baixa velocidade, e depois de granulação ribossomos por centrifugação de alta velocidade 1. Enquanto uma novela poucos métodos têm sido utilizados para a purificação ribossomos bacterianos, o mesmo não tinha sido verdade para eucariontes 2-4. Embora as etapas foram adicionadas ao longo dos anos, lava o sal por exemplo, almofadas e glicerol (por exemplo, ver 5), estudos bioquímicos e estruturais dos ribossomos de levedura tem sido prejudicado por sua tendência a tornar-se degradadas por enzimas endógenas degradante durante o processo de purificação, o mais provável devido ao longo período de tempo durante as etapas de ultracentrifugação, durante o qual os ribossomos são expostos a essas classes de enzimas 6.
O maior problema associado com protocolos tradicionais é o co-purificação de proteases e nucleases com ribossomos. Isso resulta em sua degradação durante ao processo de purificação, resultando em rendimentos mais baixos dos ribossomos bioquimicamente ativas. Os altos níveis de proteases e nucleases presentes em amostras clínicas de bactérias patogênicas, levou ao desenvolvimento de um método cromatográfico para purificação ribossomo usando uma cisteína cobrado Sulfolink resina 7. Os rRNAs e das proteínas derivadas de ribossomos bacterianos isolados usando este método mostraram níveis muito mais baixos de degradação, e os ribossomos tão purificado foram significativamente mais capazes de se ligar a eritromicina e sintetizar proteínas. A química específica de ligação ao ribossomo resina Sulfolink é desconhecida, entretanto tem-se especulado que envolve interações hidrofóbicas 7. Estas observações sugerem que a cisteína cobrado Sulfolink método de cromatografia de resina podem também ser aplicável a ribossomos de levedura, e se sim, que poderia resolver muitos dos problemas descritos acima. Assim, adaptou este protocolo para isolamento de leveduras intactas ribo, altamente ativosomes. O método de cromatografia de coluna de forma rápida e eficiente resulta em separação de uma fração significativa de contaminação nucleases e proteases de ribossomos, resultando em mais puro, mais bioquimicamente ativas preparações ribossomo com melhores propriedades bioquímicas e estruturais, que dimensiona bem a maior quantidade de ribossomos 8. Não foram observadas diferenças significativas em um gel de proteína desnaturação entre tradicionalmente ribossomos purificada e aqueles purificada através de cromatografia de coluna, indicando que estes ribossomos conter todos os mesmos elementos ribossomal como ribossomos tradicionalmente purificada.
Existem alguns passos no protocolo que requerem atenção especial. Com relação ao rompimento de células de levedura, uma proporção de 1:1 precisa de suspensão de células para contas de vidro (vol / vol) é crítico. Tipicamente, ~ 80% das células são rompidas em 2 min. Importante, mais perturbação-devem ser evitados para impedir a liberação de enzimas degradantes de organelas celulares.Embora ribossomos obtidos diretamente a partir da coluna Sulfolink mostraram-se quase completamente livre de contaminação da protease e nuclease, a observação de níveis elevados de tRNA nessa fração indicaram que a resina se liga tRNA bem 7,8. Descobrimos que a presença de espécies tRNA interfere com a jusante ensaios bioquímicos, por exemplo ligação ribossomo / ligante, ensaios de atividade peptidiltransferase e análises estruturais rRNA. Puromicina tratamento 9 de resultados isolados cromatograficamente ribossomos na produção de peptidil-puromicina, que é liberado a partir de ribossomos, juntamente com tRNAs deacylated 10-14. A centrifugação velocidade final alta durante a noite de amostras através de uma almofada de glicerol é fundamental para a remoção do tRNAs livre restante das amostras de ribossomo. Se subunidades separados são necessários, podem ser obtidas por sedimentação através de um alto gradiente de sal de sacarose 15
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Queremos agradecer a todos os membros do laboratório Dinman, incluindo Ashton Belew, Jack Karen, Musalga Sharmishtha, Sulima Sergey, Reddy Shivani, e Michael Rhodin pela sua ajuda e de entrada neste projeto. Este trabalho foi suportado por concessões de AM da American Heart Association (AHA 0630163N) e JDD do National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL foi apoiada por um americano e Reinvestimento Lei de Recuperação de 2009 suplemento para a concessão dos pais (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
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