Summary
Загрязнение подготовки эукариотических рибосом очищают традиционными методами путем совместной очистки нуклеаз и протеаз отрицательно влияет на течение биохимических и структурных анализов. Быстрый и простой хроматографический метод очистки используется для решения этой проблемы с помощью дрожжей рибосомы в качестве модельной системы.
Abstract
Эукариотической рибосомы являются гораздо более лабильны по сравнению с их эубактерий и archael коллег, что создает серьезную проблему для исследователей. Особенно беспокойство тот факт, что лизис клетки-релизы большое количество протеаз и нуклеаз, которые могут ухудшить рибосом. Таким образом, важно, чтобы отдельные рибосом из этих ферментов как можно быстрее. К сожалению, обычные методы дифференциального центрифугирования листьев рибосомы подвергаются воздействию этих ферментов для неприемлемо длительных периодов времени, воздействуя на их структурной целостности и функциональности. Для решения этой проблемы, мы используем хроматографический метод с использованием цистеин взимается Sulfolink смолы. Это простое и быстрое применение значительно снижает совместно очистки протеолитических и nucleolytic деятельность, производя высокие урожаи нетронутыми, высоко биохимически активные рибосомы дрожжей. Мы полагаем, что этот метод должен быть применим и к млекопитающим рибосом. Простотаметод, и расширение чистоты и активности хроматографически очищенный рибосома представляет собой значительный технический прогресс в изучении эукариотических рибосом.
Protocol
1. Подготовка цистеина взимается Sulfolink смолы
- Подготовка Sulfolink смолы (Pierce) при комнатной температуре.
- Место в общей сложности 10 мл 50% суспензии Sulfolink связи гель, поставляемые производителем в двух 10 мл пластиковые пробирки с 5 мл распределяется в каждом флаконе.
- Кратко центрифуги флаконах по 850 мкг и осторожно удалите супернатанты.
- Вымойте гель три раза в связи буфера (50 мМ Трис, рН 8,5, 5 мМ ЭДТА) по ресуспендирования бусин в 5 мл, центрифугирование кратко при 850 мкг и удаление супернатант пипетки.
- Добавьте пять мл 50 мМ раствора L-цистеина в связи буфера в каждую пробирку и смешать суспензию в течение 1 часа при 25 ° C.
- Удаление остаточного L-цистеин промывкой, как описано в пункте 1.4 выше.
- Ресуспендируют гель в 10 мл буфера для связывания [20 мМ HEPES, рН 7,6, 5 мМ Mg (OAc) 2, 60 мМ NH 4 Cl, 2 мМ DTT], и равновесие смолы промывкой в 10 мл буфера для связывания3 раза, как описано в пункте 1.4. Декантировать смолы в 10 мл центрифугу колонка, шапка и хранили при температуре 4 ° С. Смола потенциал для связывания РНК ~ 20 260 единиц на мл.
2. Хроматографическая очистка рибосом использованием цистеин взимается Sulfolink смолы
Примечание: При работе со штаммом, где протеазы деятельности оказывается вопрос, коктейли протеазы торможение может быть использована во всех последующих буферов.
- Поддерживать все компоненты на льду и подготовить все решения с использованием РНКазы без воды и стерильной фильтрации.
- Расти дрожжевых клеток в течение ночи с середины логарифмической фазы (OD 595 = 0,6 - 1,2) в соответствующих средствах массовой информации. Гранул клетки центрифугированием и вымыть 1 грамм клетки в связывании буфера и центрифуге при 3700 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° C.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл буфера для связывания к приближенному общем объеме 2 мл, и сорвать использованием равным объемом 0,5 бисером мм стекло охлажденным до 4 ° С сопеть БИОСПЕК Мини-бусинки колотушки (Bartlesville, OK). Образцы могут быть разбита на несколько труб по мере необходимости.
- Удалить непрерывной клетки, органеллы и клеточное мусора путем центрифугирования при 30000 мкг в течение 30 минут в Beckman Coulter Optima-Макс E ультрацентрифуге (Фуллертон, Калифорния).
- Непосредственно перед использованием, гранул смолы в течение одной минуты при 1000 мкг для удаления решение для хранения данных. Два мл смолы используется для каждого одного грамма клеток.
- Удалить надосадочную жидкость Клеточный лизат из 30 000 мкг спина (S30), с учетом необходимости минимизации загрязнения либо из липидной фракции на самом верху или клетка мусора в нижней части трубы, и поместить непосредственно в заряженной Sulfolink суспензии. Липидного слоя можно избежать, либо путем удаления или при нажатии из пипетки после кончик уже не перешла в супернатант.
- Выдержите смесь S30/Sulfolink на льду без перемешивания в течение 15 минут.
- Место столбцов в 15 мл конические пробирки и центрифуги в 1000 XG длят за одну минуту.
- Место flowthrough фракций обратно в столбцах, перемешать вручную, и выдержать в течение еще 15 минут на льду.
- Место столбцов в 15 мл конические пробирки и центрифуге при 1000 мкг в течение одной минуты. Отменить flowthrough.
- Cap колонн и добавляют 5 мл буфера для связывания. Смешайте столбцов вручную до ресуспендировали, удалять шапки, и центрифуга столбцов центрифуге при 1000 мкг в течение одной минуты. Повторите эту стиральную протокол еще два раза.
- Добавить 1,5 мл элюирующего буфера (20 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 10 мМ Mg (OAc) 2, 500 мМ KCl, 2 мМ ДТТ, 0,5 мг / мл гепарина) для каждого столбца. Смешайте растворы вручную, и инкубировать на льду в течение 2 минут
- Место столбцов в новые 15 мл конические пробирки и центрифуге при 1000 мкг на 1 минуту. Сбор элюата. Повторите элюирования шаг еще раз, так что окончательные объединенные объемы образца ~ 3 мл. Используется смолы можно мыть элюции буфера без гепарина и затем уравновешивания с обязательным buffeг, и хранится в 10 мл объема буфера для связывания при 4 ° С для повторного использования в последующем.
3. Пуромицин лечения
Примечание: альтернативный метод для удаления загрязняющих тРНК видов заключается в переходе от глюкозы богатых глюкозой обедненного СМИ для продвижения рибосомы стока. Однако это изменение метаболического статуса дрожжевых клеток, которые могут повлиять на функции рибосом и концентрации.
Для того, чтобы лишить рибосом из эндогенных пептидил-тРНК, лечение пуромицин не выполняется.
- Нейтрализовать до рН 7,5 100 Решение пуромицин мМ, добавляя по каплям 1М КОН при комнатной температуре.
- Добавить нейтрализованы пуромицин решение ~ 1 мМ конечной концентрации в элюата.
- Добавьте 100 мМ GTP к конечной концентрации 1 мМ.
- Инкубировать 30 минут при 30 ° C.
4. Очистка рибосом путем осаждения через глицерина подушки
- Поместите один млподушки буфера (20 мМ HEPES, рН 7,6, 10 мМ Mg (OAc) 2, 500 мМ KCl, 2 мМ DTT, 25% глицерина) в 4 мл объема трубки ультрацентрифуге поликарбоната.
- Осторожно слой пуромицин лечение элюирования фракций в верхней части подушки, а также центрифуги образцов при 100 000 мкг на ночь при 4 ° C.
- Удалить трубы из ротора центрифуги, и аспирата супернатанты.
- Вымойте гранулы содержащие очищенные рибосомы в два раза с 1 мл подушки буфера.
- Ресуспендируют рибосом в 100 мкл буфера подушки, осторожно нарушение использованием стеклянной палочкой.
- После нарушения, крышка труб с парафильмом и трясти с умеренной скоростью в холодной комнате вихрь на один час.
- Передача содержимого микроцентрифужных трубки, центрифуги в течение 5 минут на максимальной скорости при температуре 4 ° С, и удалить супернатанты на свежий труб.
- Повторите шаги с 4,1 до 4,7 с использованием 2 мл буфера подушки и, кроме того, что 100 мкл хранения буфера (50 мМ HEPES-КОН рН 7,6, 50 мМ NH 4 Cl, 5 мМ Mg(OAc) 2, 1 мМ DTT, 25% глицерина) используется с шагом 4,4 и 4,5 вместо подушки буфера.
- Количественная очищенные рибосомы спектрофотометрически (1 260 = 20 пмоль рибосомы дрожжей), и хранят при температуре -80 ° C. Типичные результаты с 1 грамм дрожжей 300-400 пмоль рибосом.
5. Представитель результаты:
Например видов РНК, выделенная из каждого из трех основных этапов протокола показан на рисунке 2. Хотя рРНК являются основными видами настоящее время в общей сложности лизатов клетки (Т), они также содержат большое количество других видов РНК. Рибосомы очищенный от колонки Sulfolink (SL) также содержат большое количество тРНК из-за высокого сродства колонке кровать для этих видов. Лечение этой фракции с пуромицином приводит гидролиз пептидов из пептидил-тРНК, и способствует диссоциации этих видов из рибосом. Пуромицин обработанные образцы (Pm) отсутствие совместного purifyinг тРНК видов, и, следовательно, представляют собой совершенно чистой рибосом. Как сообщалось ранее 8, эти рибосомы сильно повреждена и биохимически активны, что делает их идеальным субстратом для подробного функционального и структурного анализа.
Рисунок 1. Метод блок-схем. Хроматографическая очистка рибосом использованием цистеина связаны sulfolink смолы изображен.
Рисунок 2. Представитель Анализ препаратов рибосом. Всего видов РНК были извлечены из общего лизатов клетки (Т), Sulfolink очищенные рибосомы (SL) и Sulfolink очищенные рибосомы впоследствии обработанные пуромицин и отложившейся за глицерина подушке (ТЧ). Лейн М представляет маркеров РНК размером. Группы представляют 25S и 18S рРНК, а также тРНК и другие виды РНК указаны. Всеполосы были загружены с 2 мкг РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рибосома протоколы очистки в основном связаны с лизису клеток, уборка цитозольного фракции низкой скорости вращения, а затем гранулирования рибосомы высокой скорости центрифугирования 1. Хотя несколько новых методов были использованы для очистки бактериальных рибосом, то же не было верно для эукариот 2-4. Хотя дополнительные шаги, которые были добавлены на протяжении лет, например, моет соль, глицерин и подушки (см., например, 5), биохимические и структурные исследования рибосомы дрожжей были затруднены их склонность к деградировали эндогенными унижающие ферментов в процессе очистки, скорее всего, из-за длительных периодов времени, в течение ультрацентрифугирования шаги в течение которых рибосомы подвергаются воздействию этих классов ферментов 6.
Основная проблема связана с традиционными протоколами совместного очистки протеаз и нуклеаз с рибосомами. Это приводит к их деградации в течениепроцесс очистки, что приводит к снижению урожайности биохимически активных рибосом. Высокий уровень протеаз и нуклеаз присутствуют в клинических изолятов патогенных бактерий привело к развитию хроматографический метод очистки с использованием рибосомы цистеина взимается Sulfolink смолы 7. РРНК и белков, полученных из бактериальных рибосом, выделенных с помощью этого метода, продемонстрировали более низкие уровни разложения, и рибосомы таким образом очищенная были значительно более способны связывать эритромицин и синтезировать белки. Конкретные химия связывания рибосомы к смоле Sulfolink неизвестна, однако было предположение, что речь идет гидрофобные взаимодействия 7. Эти наблюдения предположил, что цистеин взимается Sulfolink смолы хроматографии метод может быть применим и к дрожжей рибосомы, и если да, то, что сможет решить многие из проблем, описанных выше. Таким образом, мы приспособили этот протокол для изоляции неповрежденных, высокоактивных дрожжей рибохромосом. Метод колонка хроматографическая быстро и эффективно приводит к разделению значительная часть загрязняющих нуклеаз и протеаз из рибосом, в результате чего чище, биохимически активных препаратов рибосом с повышенной биохимические и структурные свойства, которое хорошо масштабируется на более высокие количества рибосом 8. Статистически значимых различий увидеть на денатурации белка геля между традиционно очищенные рибосомы и те, очищенная с помощью хроматографии на колонке, указывая, что эти рибосомы содержат все те же элементы, как рибосомных традиционно очищенные рибосомы.
Есть несколько шагов, в протокол, который требует особого внимания. Что касается разрушения дрожжевых клеток, точное соотношение 1:1 суспензии клеток на стеклянные бусы (об / об) имеет решающее значение. Как правило, ~ 80% клеток нарушается в 2 мин. Важно отметить, что чрезмерное нарушение следует избегать, чтобы предотвратить выпуск унижающие ферментов из клеточных органелл.Хотя рибосомы, полученные непосредственно от колонны Sulfolink было показано, что почти полностью свободны от загрязнения протеаз и нуклеаз, наблюдения высокого уровня тРНК в этой фракции отметил, что смола связывает тРНК, а 7,8. Мы обнаружили, что присутствие видов тРНК мешает течению биохимических анализов, например, рибосома / лиганд, анализы peptidyltransferase деятельности и рРНК структурного анализа. Пуромицин лечения 9 из хроматографически отдельные результаты рибосомы в производстве пептидил-пуромицин, который высвобождается из рибосомы, наряду с деацилированная тРНК 10-14. Окончательный ночь высокой скорости центрифугирования образцов через глицерина подушка имеет решающее значение для удаления оставшегося свободного тРНК из рибосомы образцов. Если отдельные подразделения необходимы, они могут быть получены путем осаждения через высокий градиент сахарозы соли 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Dinman, в том числе Эштон Белью, Карен Джек, Sharmishtha Musalga, Сергей Сулима, Шивани Редди, и Майкл Родин за их помощь и информацию по этому проекту. Эта работа была поддержана грантами А. М. от Американской ассоциации сердца (AHA 0630163N) и JDD из Национального института здоровья (5R01 GM058859-12). JAL была поддержана американской реинвестирования и восстановлению Закон 2009 года дополнением к родителю гранта (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).
