Summary
Förorening av beredningar av eukaryota ribosomer renas med traditionella metoder av samtidig renande nukleaser och proteaser en negativ inverkan på nedströms biokemiska och strukturella analyser. En snabb och enkel kromatografisk rening metoden används för att lösa detta problem med hjälp av jäst ribosomer som modellsystem.
Abstract
Eukaryota ribosomer är mycket mer instabil jämfört med deras färgas eubakteriecellerna och archael motsvarigheter, vilket utgör en betydande utmaning för forskarna. Särskilt besvärande är det faktum att lys av celler släpper ett stort antal proteaser och nukleaser som kan försämra ribosomer. Därför är det viktigt att skilja ribosomer från dessa enzymer så snabbt som möjligt. Tyvärr lämnar konventionell differential ultracentrifugering metoder ribosomer utsatta för dessa enzymer för oacceptabelt lång tid, vilket påverkar deras strukturella integritet och funktionalitet. För att lösa detta problem använder vi en kromatografisk metod med en cystein laddat Sulfolink harts. Detta enkla och snabba användning minskar betydligt samtidigt renande proteolytiska och nucleolytic aktiviteter, producera hög avkastning av intakta, mycket biokemiskt aktiv jäst ribosomer. Vi föreslår att metoden också ska tillämpas på däggdjur ribosomer. Enkelheten imetoden och den förbättrade renhet och aktivitet kromatografiskt renat ribosomen utgör en betydande tekniska framsteg för studiet av eukaryota ribosomer.
Protocol
1. Beredning av ett cystein laddat Sulfolink harts
- Förbered Sulfolink harts (Pierce) vid rumstemperatur.
- Placera totalt 10 ml av en 50% uppslamning av Sulfolink koppling gel som levereras av tillverkaren i två 10 ml plast flaskor med 5 ml fördelas i varje rör.
- Kortfattat centrifugera rören vid 850 xg och ta försiktigt bort supernatanter.
- Tvätta gel tre gånger i kopplingen buffert (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) genom resuspending kulorna i 5 ml, centrifugering kort på 850 XG och avlägsna supernatanten med pipett.
- Tillsätt fem ml av en 50 mM lösning av L-cystein i koppling buffert till varje rör och blanda slammet under 1 timme vid 25 ° C.
- Ta bort de kvarvarande L-cystein genom att tvätta enligt beskrivningen i steg 1,4 ovan.
- Resuspendera gelen i 10 ml bindande buffert [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mm Mg (Oac) 2, 60 mm NH 4 Cl, 2 mm DTT] och balansera hartsen genom att tvätta i 10 ml bindningsbuffert3 gånger som beskrivs i steg 1,4. Häll massan till en 10 ml centrifug kolumn, mössa och lagras vid 4 ° C. Hartset kapaciteten för RNA-bindning är ~ 20 A 260 enheter per ml.
2. Kromatografisk rening av ribosomer med hjälp av en cystein laddat Sulfolink harts
Observera: Om att arbeta med en stam där proteas aktivitet visar sig vara ett problem, kan proteas inhibition cocktails användas i alla efterföljande buffertar.
- Behåll alla komponenter på is och förbereda alla lösningar med RNase-fria vatten och steril filtrering.
- Väx jästceller natten till mitten av log fas (OD 595 = 0,6-1,2) i lämpliga medier. Pellets celler genom centrifugering, och tvätta 1 gram celler i bindande buffert och centrifugera vid 3700 xgi 5 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera cellerna i 1 ml bindningsbuffert till en ungefärlig total volym av 2 ml, och störa med en lika stor volym 0,5 pärlor mm glas kylas till 4 ° C usjunger en Biospec Mini-pärla visp (Bartlesville, OK). Prover kan vara uppdelad i flera rör som behövs.
- Ta bort obruten celler, organeller och cellulära skräp genom centrifugering vid 30.000 xgi 30 minuter i en Beckman-Coulter Optima Max E ultracentrifugen (Fullerton, Kalifornien).
- Omedelbart före användning, pellets hartset för en minut vid 1000 xg för att ta bort lagringslösning. Två ml av harts används för var och en gram celler.
- Ta bort supernatanterna cell lysat från de 30.000 xg spin (S30), var noga med att minimera förorening från antingen lipidfraktion högst upp eller cellen skräp på botten av rören, och placera direkt i laddade Sulfolink slurry. Den lipid lagret kan undvikas antingen genom att avlägsna eller genom att trycka ut från pipettera efter spetsen har passerat in i supernatanten.
- Inkubera S30/Sulfolink blandningen på is utan att blanda i 15 minuter.
- Placera kolumner i 15 ml koniska rör och centrifugera vid 1000 xg underr en minut.
- Placera flowthrough fraktioner tillbaka in i kolumner, blanda för hand, och inkubera under ytterligare 15 minuter på is.
- Placera kolumner i 15 ml koniska rör och centrifugera vid 1000 xg under en minut. Släng flowthrough.
- Cap kolumner och tillsätt 5 ml bindande buffert. Blanda kolumner för hand tills återsuspenderade, ta bort lock, och centrifugera kolumnerna centrifugera vid 1000 xg under en minut. Upprepa denna tvätt protokollet två gånger till.
- Tillsätt 1,5 ml eluering buffert (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mm Mg (Oac) 2, 500 mm KCl, 2mm DTT, 0,5 mg / ml heparin) till varje kolumn. Blanda slam för hand, och inkubera på is i 2 minuter
- Placera kolumner till nya 15 ml koniska rör och centrifugera vid 1000 xg i 1 minut. Samla eluatet. Upprepa eluering steget en gång så att den slutliga samlade provvolymer är ~ 3 ml. Bilar kåda kan tvättas med eluering buffert utan heparin följt av jämvikt med bindande Buffer, och lagras i 10 ml volymer bindande buffert vid 4 ° C för återanvändning senare.
3. Puromycin behandling
OBS: En alternativ metod för att avlägsna kontaminerande tRNA art är att byta från en glukos rik på glukos utarmat medier för att främja ribosomen avrinning. Men denna förändring av metaboliska status jästceller, vilket kan påverka ribosomen funktion och koncentration.
För att skala av ribosomer från endogen peptidyl-tRNA, en behandling med puromycin utförs.
- Neutralisera till pH 7,5 100 mM puromycin lösning genom att tillsätta 1M KOH droppvis vid rumstemperatur.
- Lägg neutraliseras puromycin lösning ~ 1mm slutlig koncentration i eluat.
- Tillsätt 100 mM GTP till en slutlig koncentration av 1 mm.
- Inkubera i 30 minuter vid 30 ° C.
4. Rening av ribosomerna genom sedimentation genom glycerol kuddar
- Placera en mlav kudde buffert (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mm Mg (Oac) 2, 500 mm KCl, 2 mm DTT, 25% glycerol) i en 4 ml volym polykarbonat ultracentrifugen rör.
- Försiktigt lager puromycin behandlas eluering fraktioner ovanpå kudden och prover centrifugera vid 100.000 xg över natten vid 4 ° C.
- Ta bort rören från centrifugrotorns och aspirera supernatanter.
- Tvätta pellets med renade ribosomer två gånger med 1 ml kudde buffert.
- Resuspendera ribosomerna i 100 ìl kudde buffert genom försiktig störningar med hjälp av en glasstav.
- Efter avbrott, täcka rören med parafilm och skaka i måttlig hastighet i ett kallt rum virvel i en timme.
- Överför innehållet till en mikrocentrifugrör centrifugeras i 5 minuter vid maximal hastighet vid 4 ° C, och ta bort supernatanter till frisk rör.
- Upprepa steg från 4,1 till 4,7 med 2 ml kudde buffert och, förutom att 100 ìl lagring buffert (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mm NH 4 Cl, 5 mm Mg(Oac) 2, 1 mM DTT, 25% glycerol) som används i steg 4,4 och 4,5 istället för kudde buffert.
- Kvantifiera renade ribosomer spektrofotometriskt (1 A 260 = 20 pmoles av jäst ribosomer) och förvara vid -80 ° C. Typiska resultat från 1 gram jäst är 300-400 pmoles av ribosomer.
5. Representativa resultat:
Ett exempel på RNA-arter ur varje av de tre viktigaste stegen i protokollet visas i Figur 2. Medan rRNAs är de stora arter som finns totalt cell lysates (T) Dessa innehåller också ett stort antal andra RNA-arter. Ribosomerna renas från Sulfolink kolumnen (SL) innehåller också en stor mängd tRNAs grund av den höga affinitet i kolumnen sängen för dessa arter också. Behandling av denna fraktion med puromycin resulterar i hydrolys av peptider från peptidyl-tRNAs och främjar dissociation av dessa arter från ribosomerna. Den puromycin behandlade prov (PM) saknar co-purifying tRNA arter, och därmed står helt ren ribosomer. Som tidigare rapporterats 8, dessa ribosomer är mycket intakt och biokemiskt aktiva, vilket gör dem idealiska substrat för detaljerad funktionella och strukturella analyser.
Figur 1. Metod flödesschema. Kromatografiska rening av ribosomer med cystein länkade sulfolink harts avbildas.
Figur 2. Representativ analys av ribosomen förberedelser. Totala RNA arter ur totalt cell lysates (T), Sulfolink renat ribosomer (SL) och Sulfolink renat ribosomer som sedan behandlas med puromycin och sedimenterade genom en glycerol kudde (PM). Lane M representerar RNA storlek markörer. Band som representerar 25S och 18S rRNAs samt tRNAs och andra RNA-arter är markerade. Allakörfält var lastade med 2 mikrogram av RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ribosomen rening protokoll innebär i grunden lyserings celler, skörda ett cytosoliskt fraktionen från en låg hastighet spinn och sedan pelletering ribosomer med hög hastighet centrifugering 1. Medan några nya metoder har använts för att rena bakteriella ribosomer, hade samma inte varit sant för eukaryoter 2-4. Trots att ytterligare steg har lagts till under åren, t ex tvättar salt och kuddar glycerol (se t.ex. 5), har biokemiska och strukturella studier av jäst ribosomer har hindrats av deras tendens att bli ned av kroppsegna enzymer under reningsprocessen, troligen grund av den långa tid under ultracentrifugering steg under vilken ribosomer är utsatta för dessa klasser av enzymer 6.
Det stora problemet är förknippade med traditionella protokoll är samtidig rening av proteaser och nukleaser med ribosomer. Detta resulterar i sin nedbrytning underreningsprocessen, vilket resulterar i lägre avkastning av biokemiskt aktiva ribosomer. Den höga nivåer av proteaser och nukleaser närvarande i kliniska isolat av patogena bakterier lett till utvecklingen av en kromatografisk metod för ribosomen rening med hjälp av en cystein laddat Sulfolink harts 7. Den rRNAs och protein från bakteriella ribosomer isoleras med hjälp av denna metod visade mycket lägre nivåer av nedbrytning, och ribosomer så renade var betydligt mer kan binda erytromycin och att syntetisera proteiner. Den specifika kemi ribosomen binda till Sulfolink harts är okänd, men det har spekulerats i att det handlar om hydrofoba interaktioner 7. Dessa observationer tyder på att cystein debiteras Sulfolink harts kromatografi metoden också kan vara tillämpliga på jäst ribosomer, och i så fall att den skulle kunna lösa många av de problem som beskrivs ovan. Således har vi anpassat detta protokoll för isolering av intakta, mycket aktiv jäst RiboSomes. Kolumnen kromatografisk metod snabbt och effektivt resultat i separation av en större del av förorenande nukleaser och proteaser från ribosomer resulterar i renare, mer biokemiskt aktiva ribosomen preparat med förbättrade biokemiska och strukturella egenskaper, som skalar väl till högre mängder av ribosomer 8. Inga signifikanta skillnader sågs på en denaturering protein gel mellan traditionellt renats ribosomer och de som renas genom kolonnkromatografi, vilket indikerar att dessa ribosomer innehåller alla samma ribosomala element som traditionellt renats ribosomer.
Det finns några steg i protokollet som kräver särskild uppmärksamhet. När det gäller störningar av jästceller, är en exakt 1:1-förhållande cellsuspension till glaspärlor (vol / vol) kritisk. Normalt är ~ 80% av celler störs i 2 min. Viktigt bör över-störningar bör undvikas för att förhindra utsläpp av nedbrytande enzymer från cell organeller.Även ribosomerna erhålls direkt från Sulfolink kolumnen visade sig vara nästan helt fri från proteas och nukleas föroreningar angav observation av höga nivåer av tRNA i denna fraktion att kådan binder tRNA samt 7,8. Vi har funnit att förekomsten av tRNA arter stör nedströms biokemiska analyser t ex ribosomen / ligandbindande, analyser av peptidyltransferasreaktionen aktivitet och rRNA strukturella analyser. Puromycin behandling 9 av kromatografiskt isolerade ribosomer resulterar i produktion av peptidyl-puromycin, som frigörs från ribosomer, tillsammans med deacylated tRNAs 10-14. Den sista natten med hög hastighet centrifugering av prover genom en glycerol kudde är avgörande för att avlägsna de återstående fria tRNAs från ribosomen prover. Om separata subenheter behövs, kan de fås genom sedimentation genom en hög salt sackaros gradient 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka alla medlemmar i Dinman laboratoriet, inklusive Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, och Michael Rhodin för deras hjälp och synpunkter på detta projekt. Detta arbete har finansierats med bidrag till AM från American Heart Association (AHA 0630163N) och JDD från National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL fick stöd av en amerikansk Reinvestment och Recovery Act av 2009 komplement till den förälder bidraget (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce, Thermo Scientific | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec Products | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Legend RT | Sorvall, Thermo Scientific | ||
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).
