Visualisere Proteiner og makromolekylære Komplekser af negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Summary

Visualisere protein prøver ved negativ farvning elektronmikroskopi (EM) er blevet en populær strukturel analyse metode. Det er nyttigt for kvantitativ strukturel analyse, såsom beregning af en 3D-rekonstruktion af molekyler blev undersøgt, og også for kvalitativ undersøgelse af kvaliteten af ​​protein præparater. I denne artikel præsenterer vi detaljerede protokoller for at forberede EM gitre, farvning prøven og visualisere prøven i et elektronmikroskop. Nybegyndere kan følge disse protokoller nemt og til at udnytte negative pletten EM som en rutine assay, ud over andre biokemiske assays, for at vurdere deres protein prøver.

Abstract

Enkelt partikel elektronmikroskopi (EM), af både negative farves eller frosset hydreret biologiske prøver, er blevet et alsidigt redskab i strukturel biologi ^1. I de senere år, har denne metode opnået stor succes med at studere strukturer af proteiner og makromolekylære komplekser ^{2, 3.} Sammenlignet med elektron cryomicroscopy (cryoEM), hvor frosne hydreret protein prøver er indlejret i et tyndt lag af glasagtige is ^4, er negativt farvning en enklere prøveforberedelse metode, hvor protein prøver er indlejret i et tyndt lag af tørret heavy metal salt for at øge prøven kontrast ^5. Den forbedrede kontrast negative pletten EM tillader undersøgelse af relativt små biologiske prøver. Ud over at fastslå tredimensionale (3D) struktur oprensede proteiner eller protein komplekser ^6, kan denne metode bruges til langt bredere formål. For eksempel plet negative EM let kan anvendes til at visualisere rensetprotein prøver, at få oplysninger såsom homogenitet / heterogenitet af prøven, dannelsen af ​​protein komplekser eller store forsamlinger, eller blot for at evaluere kvaliteten af ​​et protein præparat.

I denne video artiklen præsenterer vi en komplet protokol for at bruge en EM til at observere negativt farvet protein prøve, fra forberedelse carbon coated gitre for negativ plet EM til at erhverve billeder af negativt farvede prøve i et elektronmikroskop drives på 120kV accelerationsspænding. Disse protokoller er blevet brugt i vores laboratorium rutinemæssigt og kan let følges af nybegyndere.

Protocol

1. Udarbejdelse af EM gitre for kulstof belægning

1. Fyld et stort glas bægerglas med destilleret vand.
2. Brug et glas pipette til at droppe en enkelt dråbe Kollodium (~ 20μl, 2% i amylacetat, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) på overfladen af ​​vandet. Kollodium vil sprede sig til at danne et tyndt plastlag på vand / luft overflade Note: En første dråbe Kollodium kan bruges til at rydde vandoverfladen fra alle støvpartikler. Efter fjernelse af filmen fra den første dråbe er vandets overflade fri for støv.
3. Placer EM gitre, 400 eller 200 mesh Gilder Cu riste købes fra Ted Pella Inc. (USA), én efter én på det plastlag, flyder på vandoverfladen; Vi plejer at placere 50 ~ 100 gitre i en tæt pakning mønster, med den blanke side af nettet står ned i plastik lag (Fig. 1A). Bemærk: 400 mesh gitre er gode til rutinemæssig negative plet EM-net, der henviser til 200 mesh gitre er gode til opsamling af tilt par billeder.
4. Skær en tærtece papir med dimensionerne lidt større end det område, hvor gitre er placeret på plastlag. Placer papiret forsigtigt oven på nettet (Fig. 1B), og vent, indtil papiret bliver helt våd (Fig. 1C). Bemærk: Forskellige typer af papir har forskellig vandoptagelse satser. Det er vigtigt, at papiret ikke absorberer vand for hurtigt. For eksempel er regelmæssig filterpapir ikke godt til dette formål, fordi det absorberer vand for hurtigt og gør en masse rynker. Det kulstof film lavet af bøjet papir er ikke flad, og dermed ikke godt for indsamling tilt par billeder til tilfældige koniske tilt 3D-rekonstruktion. Man er nødt til at teste forskellige papirer for at finde en passende én. I vores laboratorium har vi brugt papirer fra notesblokke købt fra lokale købmand. Sommetider avisen papiret blev også anset for at være egnet. En anden mulighed er at bruge den relative tykke ris papir, der benyttes til kinesisk / japansk kalligrafi.
5. Hurtigt at fremlægge snit på plastfolie omkring og tæt påDen gennemvædede papir. Umiddelbart bagefter, brug et par af tang for at hente papiret med net klemt inde mellem plastfolie og papir. Læg papiret i en petriskål med nettene opad til lufttørring (Fig. 1D) Note: Det er vigtigt at lade papiret lufttørre. Tørring for hurtigt genererer mange rynker i papiret.

2. Carbon coating gitre

1. Carbon-coating maskine, der anvendes i vores laboratorium er en Cressington 208C høj vakuum Turbo Carbon coater (Ted Pella). Vores system er udstyret med en Cressington filmtykkelse skærm, der måler tykkelsen af ​​belagt carbon film baseret på princippet om, at oscillerende frekvens af et kvarts krystal ændres ved massen af ​​en deponeret film på dens overflade. Men protokollen beskrevet her kræver ikke en tykkelse skærm, da det ofte ikke er tilgængelig i alle laboratorier.
2. Slib en carbon stang med en blyantspidser (Ted Pella) og indlæse carbon stænger i kulfiber belægning machine (Fig. 2A). To stænger, den ene med en skarp spids og den anden med en flad ende er placeret mod hinanden.
3. Anvendelse af vakuum fedt på halvdelen af ​​det matte område af et glas dias og placere den ved siden af ​​net (Fig. 2B). Kun halvdelen af ​​de matterede område af objektglas bør dækkes med vakuum fedt. Bemærk: Området med vakuum fedt vil ikke ændre farve efter carbon coating. Kontrasten mellem de tilstødende områder med og uden vakuum fedt giver et estimat af tykkelse belagt kulstof.
4. Læg papiret med net på scenen af ​​carbon coating maskine. Anbring objektglas siden af ​​nettene (Fig. 2C). Bemærk: Man kan også første overførsel net belagt med plastfolie til et objektglas før coating, i tilfælde af mange gitre falde fra papiret.
5. Pump vakuumkammeret, og vente, indtil vakuum når et niveau på 10 ^-5 Torr. Bemærk: belægning med lavere vakuum ofte genererer mange gnister, hvilket resulterer i mange store kulstof partikler pånettet.
6. Øge den nuværende meget langsomt. Den skarpe spids af kulstof stangen vil først blive rød og derefter hvid som den aktuelle stigninger. Må ikke se høj lysstyrke spidsen direkte med det blotte øje. Stop stigende strøm, når belægningen starter. Glasset slide vil skifte farve fra hvid til lys grå og derefter mørk grå. Den mørke dias korrelater tykkelsen af ​​kulstof filmen er belagt. Sluk for nuværende ud til at stoppe belægningen, når den ønskede tykkelse er opnået (Fig. 2D). Note: 1) Efter gentagne carbon coating processer, belagt kulstof fra indersiden af ​​glasset glasklokke kunne mørkere dens farve. Dette gør den coatede kulstof filmen vises tykkere end den egentlig er. 2) En skærpet carbon stang kan bruges til flere coating. Skarpheden i spidsen er gradvist reduceres efter hver belægning. Den maksimale strøm er påvirket af skarpheden af ​​kulstof stangen. En frisk skærpet stang med mindre diameter kræver en relativ laverenuværende at fordampe kulstof. Senere belægning kan kræve lidt højere strøm.
7. Vent vakuumkammeret og fjerne belagt gitre til senere brug.
   Note 1. Jo mere præcis metode til at kontrollere kulstof tykkelse er ved hjælp af en lagtykkelse skærm. Eller man kan kvalitativt kalibrere farve mod den nøjagtige tykkelse målt ved skærmen. En nyttig carbon tykkelse for denne teknik er mellem 3 og 7 nm.

Dette er en enkel og nem metode til at forberede en stor mængde af kulstof belagt net, normalt ~ 100 gitre pr forberedelse. Ristene indeholder et tyndt plastlag, som normalt ikke påvirker kvaliteten af ​​de negativt farvede billede. Men, gitre udarbejdet i denne metode er ikke egnet til cryoEM. Dette lag af plast kan fjernes ved iblødsætning net til chloroform i flere timer.

3. Forberedelse uranyl formate-løsning (0,75%) for negative plet EM. De detaljerede protokollen blevbeskrevet tidligere ⁵

1. Der afvejes 37,5 mg af uranyl formiat i et lille bægerglas;
2. Tilsæt 5 ml kogende vand og rør i 5 minutter i mørke;
3. Tilføj 10μl 5M NaOH, fortsætter omrøres i 5 minutter;
4. Opløsningen filtreres ved hjælp af en sprøjte filter (Fisherbrand, 13mm sprøjte filter, 0.2μm, Nylon usterile, katalognummer 09-720-5), og gem den filtrerede opløsning i en 8ml Falcon rør dækket med alufolie;
   Note. Uranyl formiat pulver kan købes fra Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), katalognummer 22451. Uranyl formate løsning er lysfølsomt og bør holdes væk fra direkte lys, for eksempel ved at dække Falcon rør med alufolie. En frisk tilberedt opløsning har en lys gul farve (Fig. 3A). Plet løsning kan holdes på bænken i en til to uger før det begynder fældningen. Uranyl formate er surt med en pH ~ 4. Tilføjelse NaOH øger pH, men tilføjer det for hurtigteller over kan forårsage pletten til bundfald. Ud over at skabe kontrast, også uranyl formiat løser protein prøven. Fordi fiksering sats er så hurtig, den lave pH normalt ikke påvirker den samlede protein konformationer eller protein kompleks dannelse ^7.

4. Protokol for forberedelse negative plet EM gitter. Denne protokol blev beskrevet i detaljer tidligere ⁵

1. Glow-udledning carbon coated gitter ved hjælp PELCO easiGlow GlowDischarge system (Ted Pella Inc., USA). Den anvendte nuværende er 15 mA og gitre er glød udledes i 30 sek. Note. Glow-afladet net bør anvendes kort tid efter glød afladning. Vi bruger ofte nettene i mindre end 2 timer efter Glimudladningsmassespektrometre.
2. Placer to 20μl dråber destilleret vand, og to 25μl dråber uranyl formiat løsning på et stykke parafilm (Fig. 3B).
3. Hold en glød-afladet gitter ved hjælp af reverse-force anti-kapillarrør pincet med bilenbon-coatede side opad. Bemærk: Det er nødvendigt at bruge anti-kapillarrør pincet. Ellers vil flydende prøve blive suget væk fra net af kapillær kraft mellem pincet.
4. Anvend 2μl protein prøven til gløde-afladet nettet, og vent 30 sek. Bemærk: ventetid og længden af ​​Glimudladningsmassespektrometre indflydelse på koncentrationen af ​​proteiner adsorberet i nettet. Meget fortyndede prøver kræver længere adsorption gange. Dog kan langvarig adsorption ændre buffer koncentration siden vand dampe. For at opnå en ordentlig partiklerne i nettet kræver lidt trial and error tilgang.
5. Blot off the prøve ved hjælp filtrerpapir.
6. Tryk på nettet overfladen til en vanddråbe og derefter blot slukke for vandet med filtrerpapir. Gentag med 2. dråbe vand.
7. Tryk på nettet overflade til den første dråbe af pletten kort. Blot off pletten løsning med filtrerpapir.
8. Tryk på nettet overflade til den anden dråbe pletten i 20 sekunder. Blot oFF pletten løsning med filtrerpapir.
9. Tør nettet ved hjælp af et vakuum. Bemærk: Man kan også efterlade gitre på bænken eller i den kemiske hætte lufttørre. Fordelen ved vakuum tørt er, at man kan observere gitre i EM med det samme. De mulige artefakt genereret af hurtig tørring er ujævn pletten.

5. Transmissions elektron mikroskop

1. Mikroskopet anvendes i denne demonstration er en Tecnai T12 (FEI Company) er udstyret med en Gatan 4K x 4K CCD kamera.
2. Kortvarigt kontrollere tilpasning af mikroskopet, før du indsætter prøve; Bemærk: Dette er kun nødvendigt én gang pr EM session. I en model mikroskop, kan nær perfekt tilpasning blive frelst tidligere. Henter en sådan tilpasning fil skal genoprette den mikroskop tilpasning til en næsten perfekt stand.
3. Læg EM nettet i det indre tilt standard prøveholder.
4. Sæt holderen ind CompuStage af T12. Vent til pumpecyklus at fuldføre.
5. Sæt holderen ind i kolonnen. </ Li>
6. Fokus prøve og indstille en ønsket Defocus, som regel-1.5um. Bemærk: Fokusering kan opnås enten ved manuelt at fokusere bruge minimum kontrast metoden eller ved hjælp af CCD-kamera til at indfange levende billeder og beregne leve Fourier power spektret.
7. Optag et billede ved hjælp af CCD-kamera;
8. I billeder af negativt farvede proteiner prøver, er proteiner ofte set med hvid kontrast, dvs hvidt tæthed mod en mørkere baggrund. Bemærk, at mens proteinet koncentrationer i forskellige områder af samme nettet er som regel temmelig ens, gør man observere forskellige niveauer af pletter i forskellige områder af det samme net. Sommetider områder kan have ujævn farvning eller endda positiv farvning (protein vises mørke på en lys baggrund), mens nogle andre områder har perfekte pletten. Det er ofte nødvendigt at søge på nettet for at finde et godt område for billeddannelse.

6. Repræsentative resultater

Eksempler på typiske gode billeder af negativt staINED prøver, hest milt ferritin (Figur 4A), Fab (Fig. 4B), archaeal 20S proteasom (Fig. 4C) og nucleosome (Fig. 4D), er vist.

Figur 1. Udarbejdelse af kulstof belagt gitre for negative plet EM. A) Placering EM riste én efter én i en lukket pakning mønster på overfladen af Kollodium film. B) Etablering af et stykke papir lidt større end det område af nettene. C) Vent, indtil papiret bliver helt våd. D) Pick up papiret sammen med net for luft-tørring.

Figur 2. . Coating EM-gitre med carbon A) Opsætning af kulstof fordamperen: placere de to carbon stænger i belægningen apparat med en stang (til venstre) skærpes til et punkt spids. Den anden stang (til højre) har en flad overflade og kommer i kontakt med det punkt spidsen af ​​en i den modsatte sIDE. B) Anbring en lille mængde af vakuum fedt i den ene side af en fremmet objektglas. Området inden for den sorte ramme har vakuum fedt. C) Indstil gitre til overfladebehandling. Glasset slides bruges til at holde papiret på plads. Pilespidsen peger området med vakuum fedt. D) Efter belægning, er farven på objektglasset med vakuum dækket fedt ikke ændre farven. Kontrasten angiver tykkelsen af ​​coatede kulstof.

Figur 3. Illustrerer den negative farvningsproceduren. A) frisklavet (til venstre) uranyl formate løsning er gennemsigtig, uden tegn på bundfald. Efter 1 ~ 2 uger, udfælder begynde at akkumulere i bunden i bunden af ​​røret. B) Anbring to dråber (~ 25μl) destilleret vand, og to dråber uranyl formiat løsning i et stykke parafilm. Brug et par anti-kapillære tang til at holde en glød afladet carbon-belagt EM gitter med carbon sideop. En dråbe af prøven (~ 2μl) er placeret i nettet. C) Efter at have ventet i 30 sekund, skamplet løsningen med et filtrerpapir. D) Flip nettet til at røre prøven side af nettet med den første dråbe vand. Gentag trin C og D for at fuldføre processen med farvning.

Figur 4. Eksempler på EM billeder af negativt farvet protein prøver. A) Horse milt ferritin, B) fragment af antigen bindende (FAB), C) archaeal 20S proteasom og D) nucleosome. Alle billeder blev optaget med den samme forstørrelse. Skalaen bar er 20nm.

Discussion

Negativ plet EM er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at studere 3D-strukturer af oprenset protein prøver, såsom at bruge tilfældige koniske tilt ⁸ metode, som kræver indsamling af et par billeder med en fra prøve vippes til 60 ° og en fra det samme område men untilted, at beregne 3D rekonstruktioner af makromolekylære komplekser. Hertil kommer, EM negative farvning kan have mange andre applikationer, såsom screening for to-dimensionel (2D) krystaller af membranproteiner ^9, visualisere protein-komplekser i forskellige konformationer ^10, eller blot til at visualisere homogenitet og / eller heterogenitet af oprensede proteiner stikprøven derfor giver tilbagemeldinger til at forbedre proteinoprensning procedurer, osv. Det kan være en kraftig analyse for biokemikere. I denne artikel, præsenterede vi de protokoller, lige fra udarbejdelse af carbon-belagt net til indsamling af billeder af negativt farvet protein prøver i et elektronmikroskop. Som illustreret her,proceduren er forholdsvis enkel og let at følge. Hvis du forsøger at beregne 3D rekonstruktioner af prøven bliver observeret af tilfældige koniske tilt-metoden, er det nødvendigt at erhverve vippe par billeder. Men hvis udførelse enkelt partikel analyse er formålet, vil flere untilted billeder tilstrækkeligt. I begge tilfælde er yderligere billedbehandling nødvendig, og dette er uden for rammerne af denne video artiklen.

Som med enhver metode, er der ændringer af protokoller. Uranyl formate fungerer udmærket som en negativ plet reagens i de fleste tilfælde. Uranyl acetat er en anden almindeligt anvendt negative plet reagens. Det virker meget ens som uranyl formate, men med en større kornstørrelse og i mange tilfælde, lavere kontrast end uranyl formate. Fordelen ved at bruge uranyl acetat er, at løsningen holder længere end uranyl formate. Man behøver ikke at udarbejde en frisk opløsning hver eller hveranden uge. Både uranyl formiat og acetat er sure. Et oplagt problem er, atlav pH kan medføre ændringer i proteinet prøve blev undersøgt. Begge pletten løsninger også fungere som protein fikseringsmidler. En tidligere undersøgelse har vist, at både fix protein prøver hurtigt ^7. Denne hurtige fiksering gør den lave pH mindre vigtig. Under processen med farvning, faste et protein prøve bliver, før den lave pH-værdi kan inducere ændringer. Ikke desto mindre, kan andre negative pletten reagenser, såsom ammoniummolybdat og phosphorwolfram syre, giver bedre resultater for farvning prøver, når lav pH er et problem ^7. Både ammoniummolybdat og phosphorwolfram syre have en omtrent neutral pH, men kontrasten af ​​protein prøver, der genereres af disse pletter er som regel lavere end uranyl formate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collodion	Electron Microscopy Sciences	12620-30	30ml, 2% in Amyl Acetate
Gilder Cu grids	Ted Pella, Inc.	G400/G200	400/200 mesh
Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater	Ted Pella, Inc.	9260
Double pointed Carbon rod	Ted Pella, Inc.	58
Uranyl formate	Electron Microscopy Sciences	16984-59-1	99.9% purity
PELCO easiGlow GlowDischarge system	Ted Pella, Inc.	91000	Purchase at local pharmacy
Whatman #1 Filter paper	Fisher Scientific	09-805E