Summary
Visualizing Protein-Proben von negativen Fleck-Elektronenmikroskopie (EM) hat sich zu einem beliebten Strukturanalyse Methode. Es ist für die quantitative Struktur-Analyse nützlich, wie zum Beispiel die Berechnung einer 3D-Rekonstruktion der Moleküle untersucht, und auch für qualitative Prüfung der Qualität von Protein-Präparationen. In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Vorbereitung der EM-Gitter, Färbung der Probe und die Visualisierung der Probe in einem Elektronenmikroskop. Unerfahrene Benutzer können diese Protokolle einfach zu folgen und zu nutzen Negativfärbung EM als Routine-Test, zusätzlich zu anderen biochemischen Assays für die Bewertung ihrer Protein-Proben.
Abstract
Einzelne Partikel-Elektronenmikroskopie (EM), der sowohl negative als auch gebeizt oder gefroren hydratisierten biologischen Proben, hat sich zu einem vielseitigen Werkzeug in der Strukturbiologie 1. In den letzten Jahren hat diese Methode großen Erfolg in Studium Strukturen von Proteinen und makromolekularen Komplexen 2, 3 erreicht. Verglichen mit Elektronen Kryomikroskopie (cryoEM), in dem gefrorenen hydratisierten Protein-Proben in einer dünnen Schicht aus glasigem Eis 4 eingebettet sind, ist negative Färbung eine einfachere Probenvorbereitung Methode, bei der Protein-Proben in einer dünnen Schicht aus getrocknetem Schwermetallsalz eingebettet sind zu erhöhen Probe Gegensatz 5. Die verbesserten Kontrast des negativen Fleck EM ermöglicht die Untersuchung von relativ kleinen biologischen Proben. Neben der Bestimmung von dreidimensionalen (3D) Struktur der gereinigten Proteine oder Proteinkomplexe 6, kann diese Methode für viel breiter genutzt werden. Zum Beispiel, negative Färbung EM problemlos eingesetzt werden kann, um zu visualisieren gereinigtProtein-Proben, um Informationen wie Homogenität / Heterogenität der Probe, die Bildung von Protein-Komplexe und große Baugruppen, oder einfach, um die Qualität eines Proteins Vorbereitung zu bewerten.
In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein vollständiges Protokoll für den Einsatz eines EM negativ gefärbten Protein Probe zu beobachten, von der Vorbereitung Kohlenstoff beschichtete Netze für negative Färbung EM auf den Erwerb Bilder von negativ gefärbten Probe in einem Elektronenmikroskop bei 120 kV Beschleunigungsspannung betrieben. Diese Protokolle haben in unserem Labor routinemäßig und lassen sich leicht um unerfahrene Anwender zu beachten.
Protocol
1. Vorbereitung der EM-Gitter für Kohlenstoff-Beschichtung
- Füllen Sie einen großen Becherglas mit destilliertem Wasser.
- Verwenden Sie eine Glaspipette auf einen einzigen Tropfen Kollodium (~ 20 &mgr; l, 2% in Amylacetat, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) auf der Oberfläche des Wassertropfens. Collodion wird sich ausbreiten, um eine dünne Kunststoffschicht auf der Wasser / Luft-Oberfläche bilden; Hinweis: Eine erste Tropfen Collodium kann verwendet werden, um die Wasseroberfläche von einer Staubpartikel klar sein. Nach dem Entfernen der Folie von den ersten Tropfen, wird die Wasseroberfläche frei von Staub.
- Legen EM-Gitter, 400 oder 200 mesh Gilder Cu Netze von Ted Pella Inc. (USA), einer nach dem anderen auf die Kunststoffschicht schwimmt auf der Wasseroberfläche gekauft; wir in der Regel Platz 50 ~ 100 Netze in einer dichten Packung Muster, mit der glänzenden Seite der Startaufstellung nach unten in die Kunststoffschicht (Abb. 1A). Hinweis: 400 mesh Gitter sind gut für die Routine negativen Fleck EM-Gitter, während 200 mesh Gitter sind gut für das Sammeln kippen Paar Bilder.
- Schneiden Sie einen Kuchence von Papier mit den Abmessungen etwas größer als der Bereich, in dem Gitter auf der Kunststoff-Schicht aufgebracht werden. Legen Sie das Papier vorsichtig auf der Oberseite des Gitters (Abb. 1B), und warten, bis das Papier wird komplett nass (Abb. 1C). Hinweis: Verschiedene Arten von Papier haben unterschiedliche Wasseraufnahme Raten. Es ist wichtig, dass das Papier nimmt kein Wasser zu schnell. Zum Beispiel, ist eine regelmäßige Filterpapier nicht gut für diesen Zweck, da es Wasser aufnimmt zu schnell und macht eine Menge von Falten. Die Carbon-Folie von zerknittertes Papier gemacht ist nicht flach, und somit nicht gut für das Sammeln kippen Paar Bilder für zufällige konische Neigung 3D-Rekonstruktion. Man muss verschiedene Papiere Test, eine geeignete zu finden. In unserem Labor haben wir mit Papieren aus Notizblöcke aus lokalen Lebensmittelgeschäft gekauft. Manchmal ist das Zeitungspapier war auch als geeignet erwiesen. Eine weitere Möglichkeit ist die relative dicke Reispapier für chinesische / japanische Kalligraphie verwendet wird.
- Schnell machen Einschnitte auf der Kunststoff-Folie rund um und in der NäheDie eingeweichte Papier. Unmittelbar danach, verwenden Sie eine Zange zu holen das Papier mit der Stromnetze zwischen den Kunststoff-Folie und Papier eingeklemmt. Legen Sie das Papier in einer Petrischale mit dem Gitter nach oben für die Lufttrocknung (Abb. 1D); Hinweis: Es ist wichtig, damit das Papier an der Luft trocknen. Trocknung zu schnell erzeugt viele Falten im Papier.
2. Carbon-Beschichtung Gitter
- Die Kohlenstoff-Beschichtungsanlage in unserem Labor verwendet eine Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon-Coater (Ted Pella). Unser System ist mit einem Cressington Schichtdicke Monitor, der die Dicke des beschichteten Kohlenstoff-Film basiert auf dem Prinzip, dass die Schwingungsfrequenz eines Quarz von der Masse eines abgeschiedenen Films auf seiner Oberfläche verändert Maßnahmen ausgestattet. Die beschriebenen Protokoll hier nicht erforderlich eine Stärke zu überwachen, da sie oft nicht in jedem Labor zur Verfügung.
- Schärfen eines Kohlestab mit einem Spitzer (Ted Pella) und laden Kohlestäbe in Kohlenstoffbeschichtung machine (Abb. 2A). Zwei Stäbe, mit einer scharfen Spitze und das andere mit einem flachen Ende gegeneinander gestellt.
- Anlegen von Vakuum Fett auf die Hälfte der mattierten Fläche von einem Glasträger und legen Sie sie neben dem Gitter (Abb. 2B). Nur die Hälfte der mattierten Fläche der Glasplatte sollte mit Vakuumfett abgedeckt werden. Hinweis: Die mit Vakuumfett wird sich nicht ändern Farbe nach Carbon-Beschichtung. Der Kontrast zwischen den angrenzenden Gebieten mit und ohne Vakuum Fett liefert eine Abschätzung der Dicke des beschichteten Kohlenstoff.
- Legen Sie das Papier mit Gittern auf der Bühne des Kohlenstoff-Beschichtung Maschine. Legen Sie den Objektträger neben dem Gitter (Abb. 2C). Hinweis: Man kann auch zuerst übertragen Gitter mit der Kunststoff-Folie auf einen Glasträger beschichtet vor der Beschichtung, bei vielen Netzen fallen aus dem Papier.
- Pump die Vakuumkammer und warten, bis das Vakuum erreicht ein Niveau von 10 -5 Torr. Hinweis: Beschichtung mit geringer Unterdruck erzeugt oft viele Funken, was zu vielen großen Kohlenstoff-Teilchen aufdas Netz.
- Erhöhen Sie die aktuelle sehr langsam. Die scharfe Spitze der Kohlestab wird zuerst rot und dann weiß wie der Strom steigt. Schauen Sie nicht die hohe Helligkeit Spitze direkt mit dem bloßen Auge. Stoppen steigendem Strom, wenn die Beschichtung beginnt. Die Glasplatte wird Farbe von weiß zu grau ändern und dann dunkelgrau Licht. Die Dunkelheit der Folien korreliert die Dicke der Kohleschicht beschichtet. Schalten Sie den Strom aus der Beschichtung zu stoppen, wenn gewünschte Dicke erreicht ist (Abb. 2D). Anmerkung: 1) Nach wiederholten Kohlenstoff Beschichtungsverfahren beschichtet Kohlenstoff aus dem Inneren der Glasglocke konnte dunkler die Farbe. Dies macht den beschichteten Kohlenstoff-Film dicker erscheinen als es tatsächlich ist. 2) Eines geschärft Kohlestab kann für mehrere Beschichtung verwendet werden. Die Schärfe der Spitze allmählich nach jeder Beschichtung reduziert. Der maximale Strom wird durch die Schärfe der Kohlestab beeinflusst. Ein frisch gespitzten Stab mit kleinerem Durchmesser erfordert eine relativ niedrigereStrom zu Kohlendioxid verdampfen. Später Beschichtung erfordern etwas höheren Strom.
- Vent der Vakuumkammer und entfernen Roste für die spätere Verwendung.
Hinweis 1. Die genauere Methode zur Steuerung der Kohlenstoff Dicke wird durch die Verwendung einer Schichtstärke zu überwachen. Oder man kann qualitativ kalibrieren Farbe gegen die genaue Dicke des Monitors gemessen. Ein nützliches Kohlenstoff Dicke für diese Technik liegt zwischen 3 und 7 nm.
Dies ist eine einfache und schnelle Methode, um eine große Menge an Kohlenstoff beschichtete Netze vorzubereiten, in der Regel ~ 100 Netze pro Präparat. Die Gitter enthalten eine dünne Kunststoffschicht, die in der Regel keinen Einfluss auf die Qualität der negativ gefärbten Bild. Allerdings sind Netze in diesem Verfahren hergestellte nicht geeignet für cryoEM. Diese Schicht aus Kunststoff kann durch Einweichen der Netze in Chloroform für mehrere Stunden entfernt werden.
3. Vorbereitung Uranyl Formiatlösung (0,75%) für negative Färbung EM. Das detaillierte Protokoll wurdebeschrieben bisher 5
- Abwiegen 37,5 mg des Uranyl-formiat in ein kleines Becherglas;
- 5 ml kochendem Wasser und rühren Sie für 5 Minuten im Dunkeln;
- Add 10 &mgr; l 5 M NaOH, weiter rühren 5 Minuten;
- Filtern Sie die Lösung mit einer Spritze Filter (Fisherbrand, 13mm Spritzenfilter, 0,2 um, Nylon unsteril, Katalog-Nummer 09-720-5), und speichern Sie die filtrierte Lösung in einer 8ml Falcon-Röhrchen mit Alufolie bedeckt;
Hinweis. Uranyl Formate Pulver kann von Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), Bestellnummer 22451 bezogen werden. Uranyl Formiatlösung ist lichtempfindlich und sollte weg von direktem Licht gehalten werden, zum Beispiel durch das Abdecken der Falcon-Röhrchen mit Alufolie abdecken. Eine frisch hergestellte Lösung hat eine hellgelbe Farbe (Abb. 3A). Stain-Lösung kann auf der Bank für 1-2 Wochen aufbewahrt werden, bevor es ausfällt beginnt. Uranyl Formiat sauer mit einem pH ~ 4. Hinzufügen NaOH erhöht den pH-Wert, aber das Hinzufügen zu schnelloder im Überschuss kann dazu führen, den Fleck zu fällen. Neben der Erzeugung von Kontrast, Uranyl-formiat behebt auch das Protein Probe. Da die Fixierung Rate ist so schnell, den niedrigen pH-Regel keinen Einfluss auf die gesamte Proteinkonformationen oder Protein-Komplexbildung 7.
4. Protokoll für die Vorbereitung Negativfärbung EM Gitter. Dieses Protokoll wurde im Detail beschrieben bisher 5
- Glimmentladung Kohlenstoff beschichtet Raster, mit PELCO easiGlow GlowDischarge System (Ted Pella Inc., USA). Die aktuelle Verwendung 15 mA und Gitter sind Leuchten für 30 Sekunden. Beachten Sie entladen. Glow-entladen Netze kurz nach Glühen Entladen verwendet werden sollte. Wir verwenden oft die Netze in weniger als 2 Stunden nach der Glimmentladung.
- Legen Sie zwei 20 &mgr; l Tropfen destilliertes Wasser und zwei 25 &mgr; l Tropfen Uranyl Formiatlösung auf einem Stück Parafilm (Abb. 3B).
- Halten Sie ein glow-entladen Gitter mit Reverse-force anti-Kapillare Pinzette mit dem Autobon-beschichteten Seite nach oben zeigt. Hinweis: Es ist notwendig, um anti-Kapillare Pinzette verwenden. Andernfalls wird flüssige Probe vom Gitter durch die Kapillarkraft zwischen der Zange angesaugt werden.
- Übernehmen 2μl Protein Probe auf die glow-entladen Netz, und warten Sie 30 Sekunden. Hinweis: Die Wartezeit und die Länge der Glimmentladung Einfluss auf die Konzentration von Proteinen in das Gitter adsorbiert. Sehr verdünnte Proben erfordern längere Adsorptionszeiten. Allerdings kann eine längere Adsorption Änderung der Konzentration des Puffers, da Wasserdampf. Um eine ordnungsgemäße Partikelverteilung in Grid erfordert etwas Versuch und Irrtum-Methode.
- Blot aus der Probe mit Filterpapier.
- Berühren Sie das Grid Oberfläche eines Wassertropfens und dann anschließend das Wasser abtupfen mit Filterpapier. Wiederholen Sie mit dem 2. Tropfen Wasser.
- Berühren Sie das Grid Oberfläche, um die ersten Tropfen Fleck kurz. Blot Sie den Fleck Lösung mit Filterpapier.
- Berühren Sie das Grid Oberfläche auf den zweiten Tropfen Fleck für 20 Sekunden. Blot off Färbelösung mit Filterpapier.
- Trocknen Sie die Gitter mit einem Vakuum. Hinweis: Man kann auch verlassen Gitter auf der Bank oder in einer chemischen Haube an der Luft trocknen. Der Vorteil der Vakuum trocken ist, dass man die Netze in der EM sofort zu beobachten. Die möglichen Artefakt durch schnelle Trocknung erzeugt ungleichmäßige Flecken.
5. Transmissions-Elektronenmikroskop
- Das Mikroskop in dieser Demonstration wird ein Tecnai T12 (FEI Company) mit einem Gatan 4K x 4K CCD-Kamera ausgestattet.
- Kurz überprüfen Sie die Ausrichtung des Mikroskops vor dem Einsetzen Probe; Hinweis: Dies ist nur erforderlich, einmal pro EM-Sitzung. In einem Modell Mikroskop können nahezu perfekte Ausrichtung einer älteren Version gespeichert werden. Lädt eine solche Ausrichtung Datei sollte dem Mikroskop Ausrichtung auf eine nahezu perfekte Zustand wiederherzustellen.
- Laden Sie die EM Gitter im Singleframe kippen Standard Probenhalter.
- Legen Halter in CompuStage der T12. Warten Sie auf den Pumpzyklus in Anspruch nehmen.
- Setzen Sie den Halter in die Spalte. </ Li>
- Fokus Probe und eine gewünschte Unschärfe, in der Regel-1.5um. Hinweis: Die Fokussierung kann entweder manuell durch Fokussierung mit dem minimalen Kontrast-Methode oder mittels CCD-Kamera Live-Bilder erfassen und berechnen leben Fourier Leistungsspektrum erreicht werden.
- Rekord ein Bild mit CCD-Kamera;
- In Bilder von negativ angefärbten Proteine Proben, sind Proteine, oft mit Weiß-Kontrast, also weiß Dichte gegen einen dunkleren Hintergrund zu sehen. Beachten Sie, dass während der Protein-Konzentrationen in verschiedenen Bereichen des gleichen Raster sind in der Regel sehr ähnlich, man muss unterschiedliche Färbung in verschiedenen Bereichen des gleichen Raster zu beobachten. Manche Gebiete haben könnte ungleichmäßige Färbung oder sogar positive Färbung (Protein erscheint dunkel auf hellem Hintergrund), während einige andere Gebiete perfekte Fleck haben. Es ist oft notwendig, das Netz Suche auf einem guten Bereich für die Bildgebung zu finden.
6. Repräsentative Ergebnisse
Beispiele für typische gute Bilder von negativ stainiert Proben, Pferd Ferritin (Abbildung 4A), Fab (4B), Archaea 20S Proteasom (Abb. 4C) und Nukleosomen (Abb. 4D), gezeigt werden.
Abbildung 1. Vorbereitung von Kohlenstoff Roste für negative Färbung EM. A) Plazierung EM-Gitter one-by-one in einer geschlossenen Verpackung Muster auf der Oberfläche von Kollodium Film. B) Platzierung ein Stück Papier etwas größer als die Fläche der Netze. C) Warten Sie, bis das Papier wird komplett nass. D) Nehmen Sie das Papier zusammen mit den Gittern für Luft-Trocknung.
Abbildung 2. . Coating EM-Gitter mit Kohlenstoff-A)-Setup des Kohlenstoffs Verdampfer: Legen Sie die beiden Kohlenstoff-Stäbchen in der Beschichtungsanlage, mit einem Stab (links) geschärft zu einem Punkt Spitze. Die andere Stange (rechts) hat eine flache Oberfläche und kommen in Kontakt mit dem Punkt Spitze des einen in die entgegengesetzte side. B) Legen Sie eine kleine Menge Vakuumfett in einer Seite eines gefördert Glasträger. Der Bereich innerhalb des schwarzen Rahmens ist Vakuumfett. C) Setup der Netze für die Beschichtung. Die Glasträger werden verwendet, um das Papier in Position zu halten. Die Pfeilspitze zeigt den Bereich mit Vakuum-Fett. D) Nach der Beschichtung wird die Farbe der Folie mit Vakuum-Fett bedeckt nicht die Farbe. Der Kontrast zeigt die Dicke des beschichteten Kohlenstoff.
Abbildung 3. Veranschaulichung der negativen Färbung. A) Frisch zubereitete (links) Uranyl Formiatlösung ist transparent, ohne Anzeichen von Niederschlägen. Nach 1 bis 2 Wochen Niederschläge beginnen, der sich in der unteren in die Boden des Röhrchens. B) Legen Sie zwei Tropfen (~ 25 &mgr; l) aus destilliertem Wasser und zwei Tropfen Uranyl Formiatlösung in einem Stück Parafilm. Verwenden Sie ein Paar anti-Kapillare Pinzette, um einen Schein entlassen Kohlenstoff-beschichteten EM-Gitter mit Kohlenstoff Seite haltenup. Ein Tropfen der Probe (~ 2μl) ist in das Gitter gelegt. C) Nach einer Wartezeit von 30 Sekunden, trocknen Sie die Lösung mit einem Filterpapier. D) Flip Startplatz auf die Probe Seite des Gitters mit dem ersten Tropfen Wasser zu berühren. Wiederholen Sie den Schritt C und D, um den Prozess der Färbung abzuschließen.
Abbildung 4. Beispiele für EM-Bilder von negativ gefärbten Protein-Proben. A) Pferd Ferritin, B) Fragment des Antigen-Bindung (Fab), C) Archaea 20S Proteasom und D) Nukleosomen. Alle Bilder wurden mit der gleichen Vergrößerung aufgenommen. Der Maßstab ist 20nm.
Discussion
Negative Fleck EM ist ein leistungsstarkes Tool, mit dem 3D-Strukturen von gereinigtem Protein-Proben, wie z. B. die Verwendung zufälliger konische Neigung 8-Methode, die das Sammeln ein Paar Bilder mit einem von der Probe gekippt, um 60 ° und einer aus der gleichen Gegend erfordert Studie kann aber ungekippten, um 3D-Rekonstruktionen von makromolekularen Komplexen zu berechnen. Darüber hinaus, negative Färbung EM kann noch viele andere Anwendungen, wie zB Screening für zweidimensionale (2D) Kristalle von Membranproteinen 9, Visualisierung Protein-Komplexe in verschiedenen Konformationen 10, oder einfach nur zur Visualisierung von Homogenität und / oder Heterogenität von gereinigten Proteinen Probe so Bereitstellung von Rückmeldungen zum Proteinreinigung Verfahren zu verbessern, usw. Es kann ein leistungsfähiges Test für Biochemiker werden. In diesem Artikel haben wir die Protokolle von der Vorbereitung der Kohlenstoff-beschichteten Gitter zu sammeln Bilder von negativ angefärbten Protein-Proben in einem Elektronenmikroskop. Wie hier dargestellt,das Verfahren ist relativ einfach und leicht zu folgen. Wenn Sie versuchen, 3D-Rekonstruktionen der Probe durch zufällige konische Neigung Methode beobachtet zu berechnen, ist es notwendig, kippen Paar Bilder zu erwerben. Allerdings, wenn die Durchführung Einzelpartikelanalyse ist der Zweck, werden mehrere ungekippten Bilder ausreichen. In beiden Fällen ist eine weitere Bildverarbeitung erforderlich, und dies würde den Rahmen dieses video Artikel.
Wie bei jeder Methode gibt es Änderungen an den Protokollen. Uranyl-formiat funktioniert sehr gut als eine negative Färbung Reagenz in den meisten Fällen. Uranylacetat ist eine weitere häufig eingesetzte Negativfärbung Reagenz. Es funktioniert sehr ähnlich wie Uranyl Formiat, aber mit einer größeren Korngröße und, in vielen Fällen einen geringeren Kontrast als Uranyl-Formiat. Der Vorteil der Verwendung Uranylacetat ist, dass die Lösung länger als Uranyl-formiat dauert. Man braucht nicht zu einer frischen Lösung vorzubereiten alle ein bis zwei Wochen. Beide Uranyl Formiat und Acetat sind sauer. Ein offensichtliches Problem ist, dass dieniedrigen pH-Wert können Veränderungen im Protein zu untersuchende Probe zu induzieren. Beide Flecken Lösungen funktionieren auch als Protein Fixiermittel. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass sowohl fix Protein-Proben schnell 7. Diese schnelle Fixierung macht die niedrigen pH-Wert weniger wichtig. Während des Prozesses der Färbung, fest ein Protein Probe wird vor dem niedrigen pH-Änderungen hervorrufen kann. Dennoch können andere negative Färbung Reagenzien, wie Ammoniummolybdat und Phosphorwolframsäure, bessere Ergebnisse für die Färbung Proben bei niedrigen pH-Wert ist ein für 7. Beide Ammoniummolybdat und Phosphorwolframsäure einen etwa neutralen pH-Wert, sondern der Kontrast der Protein-Proben von diesen Flecken erzeugt wird, in der Regel schlechter als Uranyl-Formiat.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Elektronenmikroskopie Arbeit bei Cheng Labor wird zum Teil durch Zuschüsse aus NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 und P50GM082250 (zu A. Frankel)), und einen Zuschuss von UCSF Programm der Durchbruch Biomedical Research, Opportunity Award und New Technology Award zu unterstützen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
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