Summary
דגימות חלבון חזותי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים שלילי כתם (EM) הפך פופולרי שיטת ניתוח מבניות. זה שימושי עבור ניתוח מבניות כמותיים, כגון חישוב שחזור 3D של מולקולות הנלמד, וגם לבחינה איכותית של איכות ההכנות חלבון. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת רשתות EM, מכתים את המדגם באופן חזותי את המדגם אלקטרון במיקרוסקופ. משתמשי המחשב השני יכול לעקוב אחר הפרוטוקולים הללו בקלות לנצל שלילי כתם EM כמו assay שגרתי, בנוסף מבחני ביוכימיים אחרים, להערכת דגימות חלבון שלהם.
Abstract
חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים (EM), של מוכתם הן שליליות או קפוא דגימות ביולוגיות hydrated, הפך לכלי צדדי הביולוגיה המבנית 1. בשנים האחרונות שיטה זו זכתה להצלחה רבה בחקר מבנים של חלבונים מתחמי macromolecular 2, 3. לעומת אלקטרונים cryomicroscopy (cryoEM), שבו קפוא דגימות חלבון hydrated המוטבעים בשכבה דקה של קרח זגוגי 4, מכתים שלילי הכנה פשוטה מדגם שיטה שבה דגימות חלבון המוטבעים שכבה דקה של מלח מיובש מתכות כבדות כדי להגדיל הדגימה לעומת 5. הניגוד משופרת של כתם שלילי EM מאפשר בדיקה של דגימות ביולוגיות קטן יחסית. בנוסף לקביעת תלת ממדי (3D) המבנה של חלבונים מטוהרים או קומפלקסים חלבונים 6, שיטה זו יכולה לשמש למטרות הרבה יותר. לדוגמה, כתם שלילי EM ניתן להשתמש בקלות לדמיין מטוהריםדגימות חלבון, קבלת מידע כגון ההומוגניות / ההטרוגניות של המדגם, היווצרות של קומפלקסים חלבונים או מכלולים גדולים, או פשוט כדי להעריך את איכות הכנה חלבון.
במאמר זה וידאו, אנחנו מציגים הפרוטוקול המלא ל באמצעות EM לצפות מדגם חלבון מוכתם שלילי, החל בהכנת רשתות פחמן מצופה עבור שלילי כתם EM לרכישת תמונות של דגימה מוכתמת שלילית מיקרוסקופ אלקטרונים המופעל על המתח מאיץ 120kV. פרוטוקולים אלה שימשו במעבדה שלנו שגרתי ניתן בעקבות בקלות על ידי משתמשים טירון.
Protocol
1. הכנת EM רשתות לציפוי פחמן
- ממלאים כוס זכוכית גדול עם מים מזוקקים.
- השתמש פיפטה זכוכית לרדת טיפה אחת של הקולודיון (~ 20μl, 2% אצטט amyl, מדעי מיקרוסקופית אלקטרונים, פנסילבניה, ארה"ב) על פני השטח של המים. וממנו יתפשט כדי ליצור שכבת פלסטיק דקה על המים / משטח האוויר; הערה: ירידה הראשון וממנו ניתן להשתמש כדי לנקות את השטח מכל מים חלקיקי אבק. לאחר הסרת הסרט מירידה הראשונה, פני המים ברור של אבק.
- מקום EM רשתות, 400 או 200 גילדר רשת רשתות Cu שנרכשו טד פלה בע"מ (ארה"ב), אחד אחד על שכבת פלסטיק צף על פני המים, אנחנו בדרך כלל מקום 50 ~ 100 רשתות דפוס ואריזה קרוב, עם נוצצים בצד של הרשת כלפי מטה לתוך שכבת פלסטיק (איור 1A). הערה: 400 רשתות רשת טובים שגרתי רשתות כתם שלילי EM, ואילו 200 רשתות רשת טובים לאיסוף תמונות זוג הטיה.
- חותכים עוגהce נייר עם ממדים מעט גדול יותר מאשר באזור שבו רשתות מונחות על שכבת פלסטיק. הנח את הנייר בזהירות על גבי הרשת (איור 1B), ולחכות עד הנייר הופך רטוב לחלוטין (איור 1C). הערה: סוגים שונים של נייר יש קליטה שונה תעריפי המים. חשוב כי העיתון לא לספוג מים מהר מדי. לדוגמה, נייר פילטר רגיל לא טוב למטרה זו, משום שהוא סופג מים מהר מדי ועושה הרבה קמטים. הסרט פחמן עשויה מנייר מקומט אינו שטוח, ולכן לא טוב לאיסוף תמונות זוג להטות עבור אקראי שחזור להטות חרוטי 3D. צריך לבדוק בעיתונים שונים כדי למצוא אחד מתאים. במעבדה שלנו, יש לנו כבר משתמש הניירות ופנקסים קנה בחנות מכולת מקומית. לפעמים נייר העיתון נמצא גם להיות מתאים. אפשרות נוספת היא להשתמש בנייר אורז עבה יחסית המשמש קליגרפיה סינית / יפנית.
- במהירות לעשות חתכים על הסרט פלסטיק סביב וקרובהעיתון ספוג. מיד לאחר מכן, להשתמש זוג מלקחיים כדי להרים את הנייר עם רשתות דחוקה בין הסרט נייר פלסטיק. הנח את הנייר בצלחת פטרי עם רשתות פונה כלפי מעלה לייבוש באוויר (איור 1D); הערה: חשוב לתת הנייר אוויר יבש. ייבוש מהיר מדי יוצר קמטים רבים בעיתון.
2. פחמן רשתות ציפוי
- מכונת ציפוי פחמן המשמשים במעבדה שלנו היא 208C Cressington גבוהה טורבו אבק פחמן Coater (טד פלה). המערכת שלנו מצוידת בצג עובי הסרט Cressington, אשר מודד את עובי הסרט פחמן מצופה מבוסס על העיקרון כי תדירות נדנוד של גביש קוורץ משתנה על ידי המסה של סרט שהופקדו על פני השטח שלו. עם זאת, פרוטוקול המתואר כאן אינו מחייב לפקח על עובי, שכן הוא לעתים קרובות לא זמין במעבדה מדי.
- חדד מוט הפחמן באמצעות מחדד (טד פלה) ופחמן מוטות לטעון פחמן ציפוי מ 'achine (איור 2A). שני מוטות, אחד עם קצה חד והשני עם סיום שטוח ממוקמים אחד נגד השני.
- מריחת גריז על החצי הריק של האזור חלבית של שקופית זכוכית ולמקם אותו לצד רשתות (איור 2 ב). רק כמחצית שטח הקפואה של שקופיות הזכוכית צריך להיות מכוסה גריז ואקום. הערה: שטח עם גריז ואקום לא ישתנה צבע לאחר ציפוי פחמן. הניגוד בין האזורים הסמוכים עם או בלי שומן ואקום מספק הערכה של עובי של פחמן מצופה.
- הנח את הנייר עם רשתות על הבמה של מכונת ציפוי פחמן. מניחים את השקף זכוכית לצד רשתות (איור 2C). הערה: אפשר גם להעביר תחילה את רשתות מצופה בסרט פלסטיק זכוכית שקופית לפני הציפוי, במקרה רשתות רבות ליפול מן העיתון.
- משאבת ואקום החדר, ולהמתין עד הוואקום מגיע לרמה של 10 -5 Torr. הערה: ציפוי עם ואקום נמוך לעתים קרובות יוצרת ניצוצות רבים, וכתוצאה מכך רבים חלקיקי פחמן גדוליםאת הרשת.
- הגדלת זרם לאט מאוד. קצה חד של המוט פחמן יהיה הראשון להיות אדום ואז לבן עולה הנוכחי. אין לצפות את קצה בהירות גבוהה ישירות בעין בלתי מזוינת. עצור הגדלת הנוכחי כאשר הציפוי מתחיל. השקופית זכוכית ישתנה צבע לבן אפור בהיר ואחר כך אפור כהה. החושך של השקופיות וקושרת את עובי הסרט פחמן מצופה להיות. בטל הנוכחי לעצור כאשר עובי הציפוי הרצויה הושגה (איור 2 ד). הערה: 1) לאחר חזר ציפוי תהליכים חמצני, פחמן מצופה מבפנים צנצנת פעמון זכוכית יכול להכהות את צבעו. זה הופך את הסרט פחמן מצופה להופיע עבה יותר ממה שהיא באמת. 2) אחת מוט פחמן חידד ניתן להשתמש לציפוי מספר. חדות של קצה מצטמצם בהדרגה לאחר כל ציפוי. הזרם המרבי מושפע חדות של מוט הפחמן. מוט מחודד טרי עם קוטר קטן יותר דורש יחסית נמוךהנוכחי להתאדות פחמן. מאוחר יותר ציפוי עשויה לדרוש מעט הנוכחי גבוה יותר.
- Vent תא ואקום להסיר רשתות מצופה לשימוש מאוחר יותר.
הערה 1. השיטה מדויקת יותר של שליטה על עובי הפחמן היא באמצעות צג עובי הסרט. לחלופין, ניתן לכייל צבע איכותית נגד עובי מדויק נמדד על ידי המסך. עובי פחמן שימושי טכניקה זו היא בין 3 ל 7 ננומטר.
זוהי שיטה פשוטה וקלה להכין כמות גדולה של רשתות פחמן מצופה, בדרך כלל ~ 100 רשתות לכל הכנה. רשתות מכילים שכבת פלסטיק דקה, אשר בדרך כלל אינו משפיע על האיכות של התמונה הצבעונית שלילי. עם זאת, רשתות שהוכנו בשיטה זו אינם מתאימים cryoEM. שכבה זו של פלסטיק ניתן להסיר על ידי השריית רשתות לתוך כלורופורם במשך כמה שעות.
3. הכנת formate uranyl פתרון (0.75%) עבור שליליים כתם EM. פרוטוקול מפורטשתואר לעיל 5
- לשקול את 37.5mg של formate uranyl לתוך ספל קטן;
- הוסף 5 מ"ל מים רותחים ומערבבים במשך 5 דקות בחושך;
- הוסף 10μl 5M NaOH, להמשיך לערבב במשך 5 דקות;
- סנן את הפתרון באמצעות מזרק מסנן (Fisherbrand, 13mm מזרק מסנן, 0.2μm, ניילון לא סטריליים, מספר קטלוג 09-720-5), ולאחסן את פתרון סינון בצינור פלקון 8ml מכוסה בנייר אלומיניום;
. Uranyl הערה אבקת Formate ניתן לרכוש למדעי מיקרוסקופית אלקטרונים (Hatfield, PA), מס 'קטלוגי 22451. Formate פתרון Uranyl אור רגיש צריך להישמר במרחק של אור ישיר, למשל על ידי כיסוי הצינור פלקון עם רדיד אלומיניום. פתרון מוכן טרי יש צבע צהוב בהיר (איור 3A). פתרון הכתם יכול להיות כל הזמן על הספסל במשך שבוע עד שבועיים לפני שהוא מתחיל מזרז. Formate Uranyl הוא חומצי עם pH ~ 4. הוספת NaOH מגדיל את ה-pH, אך הוספתו מהר מדיאו עודף יכול לגרום הכתם כדי לזרז. בנוסף להפקת לעומת זאת, formate uranyl מתקן גם את מדגם חלבון. בגלל קצב קיבוע מהיר כל כך, ה-pH נמוך בדרך כלל לא משפיע על תצורות החלבון הכללית או היווצרות חלבון מורכב 7.
4. פרוטוקול להכנת שלילי רשת כתם EM. פרוטוקול זה מתואר בפירוט בעבר 5
- זוהר פריקה פחמן רשת מצופה, באמצעות PELCO easiGlow GlowDischarge המערכת (טד פלה Inc, ארה"ב). הנוכחי נעשה שימוש הוא 15 mA ורשתות הם זוהר שוחרר עבור הערה 30. שניות. Glow-משוחררים רשתות יש להשתמש מיד לאחר פריקת זוהר. לעתים קרובות אנו משתמשים ברשתות בפחות מ 2 שעות לאחר השחרור זוהר.
- Two מקום 20μl טיפות של מים מזוקקים ושתי טיפות של תמיסת 25μl formate uranyl על פיסת parafilm (איור 3B).
- החזק זוהר, שוחרר לרשת באמצעות הפוכה כוח אנטי נימי מלקחיים עם המכוניתבון מצופה צד פונה כלפי מעלה. הערה: יש צורך להשתמש אנטי נימי מלקחיים. אחרת, מדגם נוזלי יהיה נשאב ממנו רשתות בכוח נימי בין מלקחיים.
- החל מדגם חלבון 2μl לרשת, זוהר משוחררים, ולחכות 30 שניות. הערה: זמן ההמתנה ומשך הפריקה זוהר להשפיע על הריכוז של החלבונים adsorbed ברשת. דגימות מדולל מאוד לדרוש יותר פעמים ספיחה. עם זאת, ספיחה ממושכת עשויה לשנות את ריכוז חיץ מאז אדי מים. כדי להשיג פיזור החלקיקים נאות ברשת דורש קצת ניסוי בגישה שגיאה.
- כתם את המדגם בעזרת נייר פילטר.
- לגעת במשטח לרשת כדי טיפת מים ולאחר מכן למחוק את המים עם נייר סינון. חזור עם ירידה של 2 מים.
- לגעת במשטח רשת לירידה הראשון של כתם בקצרה. כתם את הפתרון הכתם בנייר מסנן.
- לגעת במשטח רשת לירידה השני של הכתם למשך 20 שניות. כתם off פתרון הכתם בנייר מסנן.
- יבש את הרשת באמצעות ואקום. הערה: אפשר גם להשאיר רשתות על הספסל או במנדף כימי לייבוש באוויר. היתרון של ואקום יבש הוא שאפשר לראות את רשתות ב EM מיד. חפץ אפשרי שנוצר על ידי ייבוש מהיר הכתם אינה אחידה.
5. הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים
- המיקרוסקופ משמש הפגנה זו היא T12 Tecnai (פיי החברה) מצויד במצלמת 4K Gatan x CCD 4k.
- בקצרה לבדוק את היישור של המיקרוסקופ לפני הכנסת מדגם: הערה: יש צורך פעם אחת בלבד לכל EM הפגישה. בשנת מיקרוסקופ מודל, ליד יישור מושלם ניתן לשמור קודם לכן. טוען כזה קובץ יישור צריך לשחזר את יישור מיקרוסקופ למצב כמעט מושלם.
- טען את רשת ב EM מחזיק את הדגימה להטות יחיד סטנדרטי.
- הכנס לתוך מחזיק CompuStage של T12. חכו במחזור שאיבה כדי להשלים.
- הכנס את מחזיק לתוך העמודה. </ Li>
- פוקוס הדגימה ולקבוע defocus הרצוי, בדרך כלל, 1.5um. הערה: ההתמקדות יכולה להיות מושגת באופן ידני או על ידי התמקדות בשיטת בניגוד מינימום או באמצעות מצלמת CCD ללכוד תמונות לחיות לחיות לחשב ספקטרום פורייה כוח.
- הקלטת תמונה באמצעות מצלמת CCD;
- ב תמונות של דגימות שלילי חלבונים מוכתם, החלבונים נראים לעתים קרובות עם ניגודיות לבנה, כלומר צפיפות לבן על רקע כהה. שים לב כי בעוד ריכוזי חלבון באזורים שונים של אותה רשת הם בדרך כלל די דומה, אחד מקיים רמות שונות של כתמים באזורים שונים של הרשת זהה. לפעמים באזורים יכול היה מכתים אחיד או אפילו מכתים חיובי (החלבון מופיע כהה על רקע בהיר), בעוד כמה תחומים אחרים יש כתם מושלמת. זה לעתים קרובות יש צורך לחפש את הרשת כדי לאתר אזור טוב הדמיה.
6. נציג תוצאות
דוגמאות של תמונות טובות אופייני שלילי staדגימות עומד לבחינה, הטחול סוס פריטין (איור 4 א), Fab (איור 4B), ה -20 archaeal הפרוטאזום (איור 4C) ו הנוקלאוזום (איור 4D), מוצגים.
באיור 1. הכנת רשתות פחמן מצופה עבור שלילי כתם א"מ.) הצבת רשתות EM אחד על אחד דפוס אריזה סגורה על פני השטח של הסרט הקולודיון. ב) הצבת פיסת נייר מעט גדול יותר בשטח של רשתות. ג) המתן עד הנייר נרטב לגמרי. ד) להרים את הנייר יחד עם רשתות לייבוש האוויר.
באיור 2. . ציפוי רשתות EM עם פחמן) הגדרת המאייד פחמן: מקום שני מוטות פחמן במנגנון ציפוי, עם מוט אחד (משמאל) חידד עד קצה נקודה. מוט אחרים (מצד ימין) יש משטח שטוח לבוא במגע עם קצה של נקודה אחת ב ההפוך sIDE. ב) מקום כמות קטנה של שומן ואקום בצד אחד של זכוכית שקופית טיפחו. האזור בתוך המסגרת השחורה יש שומן ואקום. ג) הגדרת רשתות לציפוי. שקופיות הזכוכית משמשים כדי להחזיק את נייר העמדה. ראש החץ מצביע את האזור עם שמן ואקום. ד) לאחר הציפוי, הצבעים של השקופית עם גריז ואקום מכוסה אינו משנה את הצבע. לעומת זאת מצביע על עובי של פחמן מצופה.
באיור 3. הממחישות את ההליך מכתים שלילי). טרי formate מוכן (משמאל) פתרון uranyl שקוף ללא סימן של משקעים. אחרי 1 ~ 2 שבועות, ולהתחיל לצבור משקעים בתחתית בתחתית של התחתית. ב) מקום שתי טיפות (~ 25μl) של מים מזוקקים ושתי טיפות של תמיסת uranyl formate בפיסת parafilm. השתמש זוג אנטי נימי מלקחיים להחזיק זוהר משוחררים פחמן מצופה רשת EM עם הצד פחמןמעלה. ירידה של המדגם (~ 2μl) ממוקם ברשת. ג) אחרי המתנה של 30 לשנייה, כתם הפתרון עם נייר סינון. ד) תהפכו את הרשת לגעת בצד מדגם של רשת עם טיפת המים הראשונה. חזור על השלב C ו-D כדי להשלים את התהליך של מכתים.
איור 4. דוגמאות EM תמונות של דגימות חלבון מוכתם שלילי.) הטחול פריטין סוסים, ב ') שבר מחייב האנטיגן (Fab), ג) ה -20 archaeal הפרוטאזום ו-D) הנוקלאוזום. כל התמונות נרשמו עם הגדלה זהה. סרגל קנה מידה הוא 20nm.
Discussion
כתם שלילי EM הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד 3D מבנים של חלבונים מטוהרים דגימות, כגון שימוש להטות חרוטי אקראי 8 שיטה, אשר דורש איסוף זוג תמונות עם אחד מן הדגימה מוטה 60 מעלות ואחד מאותו אזור אבל untilted, כדי לחשב 3D שחזורים של קומפלקסים macromolecular. בנוסף, מכתים שלילי EM יכולים להיות יישומים רבים אחרים, כגון בדיקה דו ממדי (2D) גבישים של חלבונים בממברנה 9, חזותי קומפלקסים חלבונים ב 10 תצורות שונות, או פשוט המאפשר הדמיה ההומוגניות / או הטרוגניות של חלבונים מטוהרים מדגם ובכך מתן פידבקים לשיפור תהליכי טיהור חלבונים, וכו 'זה יכול להיות assay עוצמה ביוכימאים. במאמר זה, הצגנו את הפרוטוקולים החל בהכנת פחמן מצופה רשתות לאיסוף תמונות של דגימות חלבון שלילי מוכתם אלקטרון במיקרוסקופ. כפי שהודגם כאן,ההליך הוא פשוט למדי וקל בצע. אם מנסים לחשב 3D שחזורים של המדגם הנצפה על ידי שיטה אקראי להטות חרוטי, יש צורך לרכוש תמונות זוג הטיה. עם זאת, אם ביצוע ניתוח חלקיק יחיד המטרה, תמונות untilted מרובים יספיק. בשני המקרים, עיבוד תמונה נוספת נדרשת וזה מעבר להיקף של מאמר זה וידאו.
כמו כל שיטה, יש וריאציות על הפרוטוקולים. Formate Uranyl עובד טוב מאוד מגיב כמו כתם שלילי ברוב המקרים. אצטט Uranyl הוא עוד מגיב נפוץ כתם שלילי. זה עובד דומה מאוד formate uranyl, אבל עם גודל גרגר גדול, במקרים רבים, לעומת נמוך יותר formate uranyl. היתרון של שימוש אצטט uranyl היא שהפתרון נמשך יותר formate uranyl. לא צריך להכין טרי כל פתרון שבועות אחד או שניים. שני formate uranyl ו אצטט הם חומציים. החשש הברור הוא כיpH נמוך יכול לגרום שינויים במדגם החלבון הנחקר. שני פתרונות כתם לפעול גם fixatives חלבון. מחקר קודם הראה כי גם חלבון דגימות לתקן במהירות 7. זה קיבעון מהיר הופך את ה-pH נמוך פחות חשוב. במהלך תהליך של צביעה, מדגם חלבון הופך להיות קבוע לפני pH נמוך יכול לגרום שינויים. עם זאת, אחרים ריאגנטים כתם שלילי, כגון אמוניום molybdate וחומצה phosphotungstic, עשוי להניב תוצאות טובות יותר עבור מכתים דגימות כאשר pH נמוך היא דאגה 7. שני molybdate אמוניום וחומצה phosphotungstic יש pH ניטרלי כ, אבל בניגוד דגימות חלבון שנוצר על ידי כתמים אלה הוא בדרך כלל נחות formate uranyl.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה במיקרוסקופ אלקטרונים ב נג מעבדה הוא בחלקו על ידי מענקי תמיכה NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 ו P50GM082250 (א 'פרנקל)), וכן מענק של קליפורניה בסן פרנסיסקו תוכנית המחקר פריצת דרך ביו, הזדמנות פרס ופרס טכנולוגיה חדשה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
- Cheng, Y., Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).
- Zhou, Z. H. Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Rabl, J. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases. Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).
- Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
- Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).
- Zhao, G. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters. J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).
- Nishida, N. Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations. Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).
