Summary
Визуализация белка образцы отрицательной окраски электронной микроскопии (ЭМ) стала популярным методом структурного анализа. Это полезно для количественного структурного анализа, таких, как расчет 3D-реконструкции исследуемых молекул, а также для качественной проверки качества белковых препаратов. В этой статье мы приводим подробные протоколы для подготовки EM сетки, окрашивание образца и визуализации образца в электронном микроскопе. Начинающие пользователи могут следующие протоколы легко и использовать отрицательную окраску EM в качестве рутинного анализа, в дополнение к другим биохимические анализы, для оценки их образцы белка.
Abstract
Одноместный электронной микроскопии частицы (ЭМ), как отрицательные окрашенных или замороженные гидратированных биологических образцов, стала универсальным инструментом в структурной биологии 1. В последние годы этот метод достиг больших успехов в изучении структуры белков и макромолекулярных комплексов 2, 3. По сравнению с электронными cryomicroscopy (cryoEM), в которых замороженные гидратированных образцов белка встроенных в тонкий слой стекловидного льда 4, отрицательный окрашивание простой метод подготовки проб, в которых белок образцы встроенных в тонкий слой сухих солей тяжелых металлов увеличить образца контраст 5. Повышенной контрастности отрицательной окраски EM позволяет исследовать относительно небольшой биологических образцов. Помимо определения трехмерных (3D) структура очищенных белков и белковых комплексов, 6, этот метод может быть использован для гораздо более широкой цели. Например, отрицательные пятна EM может быть легко использован для визуализации очищенныйбелка образцов, получение информации, такой как однородность / неоднородность образца, образование белковых комплексов или большими сборками, или просто оценить качество белкового препарата.
В этом видео статьи, мы представляем полный протокол для использования ЭМ наблюдать негативно окрашенных белков образца, от подготовки углерода покрытием сетки для отрицательных пятна ЭМ получения изображения отрицательно окрашенных образца в электронном микроскопе работать при 120kV ускоряющего напряжения. Эти протоколы были использованы в нашей лаборатории в плановом порядке и могут быть легко следуют начинающих пользователей.
Protocol
1. Подготовка EM сеток для углеродного покрытия
- Наполните большую стеклянную мензурку с дистиллированной водой.
- Используйте стеклянную пипетку, чтобы падение одной капли коллодия (~ 20 мкл, 2% в амилацетат, Электрон наук микроскопии, штат Пенсильвания, США) на поверхности воды. Коллодия будет распространяться на форму тонкого пластического слоя на границе раздела вода / воздух поверхность; Примечание: первая капля коллодия могут быть использованы для очистки поверхности воды от любых частиц пыли. После удаления пленки с первыми каплями, водная поверхность свободна от пыли.
- Место EM сеток, 400 или 200 меш Гилдер Cu сетки приобрести у Теда Пелла Inc (США), по одному на пластиковый слой, плавающих на поверхности воды; Мы обычно место 50 ~ 100 сеток в плотной упаковке узор, с блестящими сторону сетки вниз в пластиковый слой (рис. 1А). Примечание: 400 сетки сетки хороши для обычного отрицательного пятна сетки ЭМ, тогда как 200 сетки сетки хороши для сбора наклона изображения пары.
- Вырезать пирогсе бумаги с размерами чуть больше, чем область, где сетки размещаются на слой пластика. Положите бумагу тщательно поверх сетки (рис. 1б), и ждать, пока бумага становится полностью мокрой (рис. 1в). Примечание: Различные виды бумаги имеют различные ставки поглощения воды. Важно, чтобы бумага не впитывает воду слишком быстро. Например, регулярное фильтровальная бумага не подходит для этой цели, потому что он впитывает воду слишком быстро, и делает много морщин. Углеродной пленки из краев бумаги не является плоским, и поэтому не подходит для сбора наклона изображения пары случайных конической реконструкции 3D наклона. Нужно проверить различные работы, чтобы найти подходящую. В нашей лаборатории мы используем бумаги из блокнота купил у местного продуктового магазина. Иногда газетной бумаги было также установлено, что подходит. Другим вариантом является использование относительных толстой рисовой бумаги используются для китайских / японская каллиграфия.
- Быстро сделать разрезы на пластиковой пленки вокруг и рядом спропитанной бумаги. Сразу же после этого, используйте пару щипцов, чтобы забрать бумаги с сетками зажата между пленкой и бумагой. Положите бумагу в чашке Петри с сетками вверх для сушки на воздухе (рис. 1D); Примечание: Очень важно, чтобы бумага воздушно-сухой. Сушка слишком быстро генерирует множество морщин в бумагу.
2. Сетки Carbon покрытий
- Углеродного покрытия машины, используемые в нашей лаборатории Cressington 208C высокого вакуума Turbo Carbon Coater (Тед Пелла). Наша система оснащена толщина Cressington фильм монитор, который измеряет толщину пленки углерода на основе принципа, что частоты колебаний кристалла кварца изменяется масса осажденной пленки на ее поверхности. Тем не менее, протокол, описанный здесь, не требует толщину монитора, так как она часто не доступны в любой лаборатории.
- Резкость угольный стержень использованием точилка (Тед Пелла) и стержни нагрузки углерода в углеродных покрытий мachine (рис. 2). Два стержня, один с острым концом, а другой с плоским концом расположены друг против друга.
- Применение вакуумной смазки на половину площади матовом стекле и поместить его рядом с сетками (рис. 2В). Только половина из замороженного участка в стекле должна быть покрыта вакуумной смазкой. Примечание: район с вакуумной смазки не изменит цвет после углеродного покрытия. Контраст между прилегающих территорий с и без вакуумной смазкой обеспечивает оценку толщины покрытых углеродом.
- Положите бумагу с сетками на сцене углерода машины покрытием. Место стекло рядом с сетками (рис. 2). Примечание: Можно также первой сетки передачи покрыта пластиковой пленкой, чтобы стекло перед нанесением покрытия, в случае многих сетки отвалиться от бумаги.
- Насос вакуумной камере, и ждать, пока вакуум не достигнет уровня 10 -5 Торр. Примечание: покрытие с низким вакуумом часто порождает много искр, в результате чего многие крупные частицы углерода насетке.
- Увеличение текущих очень медленно. Острым наконечником из графитовых стержней сначала становятся красными, а затем белыми, как ток возрастает. Не смотрите высокой яркости наконечник непосредственно с невооруженным глазом. Стоп увеличением тока, когда покрытие начинает. Стекло будет менять цвет от белого до светло-серого, а затем темно-серый. Мрак слайды коррелирует толщина пленки углерода будучи покрытием. Включите текущей прочь к остановке, когда покрытие нужной толщины была достигнута (рис. 2D). Примечание: 1) После повторной углеродного покрытия процессы, покрытые углеродной изнутри колпаком стекло может темнеть его цвет. Это делает покрытие углеродной пленки появляются толще, чем есть на самом деле. 2) Один заостренными угольный стержень может быть использован для нескольких покрытий. Острота кончика постепенно уменьшается после каждого покрытия. Максимальный ток зависит от остроты угольный стержень. Недавно заостренным стержнем с меньшим диаметром требует относительной нижетока испаряется углерод. Позже покрытие может потребоваться несколько выше текущей.
- Vent вакуумную камеру и удалить покрытие сетки для дальнейшего использования.
Примечание 1. Более точный метод управления углерода толщиной с помощью мониторинга толщины пленки. Или можно качественно калибровки цвета с точным толщина измеряется монитора. Полезной толщины углерода для этой техники составляет от 3 до 7 нм.
Это простой и легкий способ получения большого количества углерода покрытием сетки, как правило, ~ 100 сетки на подготовку. Сетки содержат тонкий слой пластика, который обычно не влияет на качество негативно окрашенные изображения. Тем не менее, сетки, подготовленный в этот метод не подходит для cryoEM. Этот слой пластика могут быть удалены путем замачивания сетки в хлороформе в течение нескольких часов.
3. Подготовка уранила формиат решение (0,75%) за негативное пятно EM. Подробный протокол былописано выше 5
- Отвешивать 37.5mg уранила формиат в небольшой стакан;
- Добавьте 5 мл кипящей воды и перемешать в течение 5 минут в темноте;
- Добавить 10 мкл 5М NaOH, продолжать движение в течение 5 минут;
- Фильтры решения с использованием шприца фильтр (Fisherbrand, 13мм шприц фильтр, 0,2 мкм, нейлон нестерильные, каталожный номер 09-720-5), и хранить отфильтрованный раствор в трубке 8ml Сокол покрыта алюминиевой фольгой;
Примечание. Уранила Формиат порошок можно купить в электронной микроскопии наук (Hatfield, PA), номер по каталогу 22451. Решение уранила формиата светочувствительных и следует держать подальше от прямых солнечных лучей, например, покрытие трубки Сокол с алюминиевой фольгой. Свежеприготовленный раствор светло-желтого цвета (рис. 3А). Пятно решение может находиться на скамейке для одной-двух недель до его начала осаждения. Уранила формиата кислые с рН ~ 4. Добавление NaOH увеличивает рН, но и добавить его слишком быстроили в избытке может вызвать пятна на осадок. В дополнение к генерации напротив, уранил формиата также исправляет белка образца. Потому что фиксация скорости происходит настолько быстро, низкий рН обычно не влияют на общую конформации белка или белкового комплекса, образование 7.
4. Протокол для подготовки отрицательного пятна EM сетки. Этот протокол был подробно описан ранее 5
- Тлеющего разряда углерода покрытые сеткой, используя PELCO easiGlow GlowDischarge системы (Ted Пелла, США). Тока, используемого в 15 мА и сетки свечение выписан в течение 30 сек. Примечание. Раскаленной выписан сетки должны быть использованы сразу после свечения разряда. Мы часто используем сетки менее чем через 2 часа после тлеющего разряда.
- Поместите два 20 мкл капель дистиллированной воды и 25 мкл две капли уранила решение формиата на кусочек парафильмом (рис. 3В).
- Держите тлеющего выписан сетки с использованием обратной силы анти-капиллярной щипцы с автомобилембон-покрытием вверх. Примечание: Следует использовать анти-капиллярной щипцами. В противном случае, жидкого образца будет отсасывается из сетки от капиллярных сил между щипцами.
- Применить 2μl образец белка тлеющего выписан сетке, и ждать 30 сек. Примечание: время ожидания и длины тлеющего разряда влияние концентрации белков, адсорбированных в сетку. Очень разбавленные образцы требуют более адсорбции раз. Однако длительное адсорбции может изменить буфер так как концентрация водяных паров. Чтобы добиться правильного распределения частиц в сетке требует несколько проб и ошибок.
- Пятно от примера с использованием фильтровальной бумаги.
- Сенсорный сетки поверхности капли воды, а затем пятно от воды фильтровальной бумагой. Повторите второй капли воды.
- Сенсорный сетки поверхности, чтобы первая капля пятно кратко. Пятно от окраски раствора с фильтровальной бумаги.
- Сенсорный сетки поверхности на вторую каплю пятно в течение 20 секунд. Пятно оFF пятно решение фильтровальной бумагой.
- Сухой сетку, используя вакуум. Примечание: можно также оставить сетки на скамейке или в химической капотом высохнуть на воздухе. Преимущество вакуумных сухих является то, что можно наблюдать сеток в EM немедленно. Возможно артефакт порожденных быстрое высыхание неравномерно пятно.
5. Просвечивающей электронной микроскопии
- Микроскоп используется в этой демонстрации является Tecnai T12 (FEI Company) оснащен Gatan 4K 4K х камер CCD.
- Кратко проверить выравнивание микроскоп, прежде чем вставлять образца; Примечание: Это необходимо только один раз в EM сессии. В модели микроскопа, около идеального выравнивания могут быть сохранены ранее. Загрузка таких выравнивание файла должны восстановить микроскопом выравнивания около идеальном состоянии.
- Нагрузка сетки ЭМ в одном наклона стандартный держатель образца.
- Вставьте держатель в CompuStage из T12. Подождите цикла перекачки, чтобы закончить.
- Вставьте держатель в столбце. </ LI>
- Фокус образца и установить желаемый расфокусировки, как правило, 1.5um. Примечание: Фокусировка может быть достигнуто либо путем ручной фокусировки с использованием минимального метод контраста или с помощью ПЗС-камеры для съемки изображения в реальном времени и вычислительных жить мощности спектра Фурье.
- Запись изображения с помощью ПЗС-камеры;
- В образах негативно окрашенных образцов белков, белки часто видели с белый контраст, то есть белая плотностью от темного фона. Обратите внимание, что в то время как концентрации белка в различных областях же сетки, как правило, очень похожи, человек не наблюдать различные уровни пятна в разных районах одного и того же сетки. Иногда местах может иметь неравномерное окрашивание или даже положительное окрашивание (белок кажется темным на светлом фоне), тогда как в некоторых других районах в совершенстве пятно. Очень часто приходится искать сетку, чтобы найти хорошее место для съемки.
6. Представитель Результаты
Примеры типичных хорошие изображения отрицательно станцииINED образцов, лошади селезенка ферритина (рис. 4А), Fab (рис. 4б), архейных 20S протеасом (рис. 4в) и нуклеосом (рис. 4) показаны.
Рисунок 1. Подготовка углерода покрытием сетки для отрицательных пятно EM.) Размещение EM сетки одна за другой в закрытой упаковке узор на поверхности коллодия фильма. Б) Размещение лист бумаги чуть больше, чем площадь сетки. C) Подождите, пока бумага становится совершенно мокрая. D) Возьмите этот документ вместе с сетками для воздушной сушки.
Рисунок 2. . Покрытие EM сетки с углеродом) установки углерода испарителя: место двух стержней углерода в покрытии аппарата, с одной удочкой (слева) обострены до точки чаевые. Другой стержень (справа) имеет плоскую поверхность и вступают в контакт с точкой кончика один в противоположную ыязь. Б) Место небольшим количеством вакуумной смазки в одну сторону способствовали стекло. Область в черной рамке имеет вакуумной смазкой. C) установки сетки для покрытия. Предметные стекла используются для хранения бумаги в положение. Стрелки точках области с вакуумной смазкой. D) После нанесения покрытия, цвет слайд с вакуумной смазки покрыты не меняет цвет. Контраст указывает толщину покрытием углерода.
Рисунок 3. Иллюстрируя отрицательные процедуры окрашивания.) Свежеприготовленный (слева) уранила формиат раствор прозрачный без знака осадков. Через 1 ~ 2 недели, осадки начинают накапливаться в дно в нижней части трубы. Б) Место две капли (~ 25 мкл) дистиллированной воды и две капли уранила формиат решение в части парафильмом. Используйте пару анти-капиллярной щипцы провести свечение разряжен, покрытую углеродом, Е. М. сетку с углеродом стороневверх. Капли образца (~ 2μl) помещают в сетку. C) После ожидания в течение 30 секунд, промокните решение с фильтровальной бумаги. D) Флип сетки на ощупь образец сторону сетки с первой капли воды. Повторите шаг C и D для завершения процесса окрашивания.
Рисунок 4. Примеры EM образы негативно окрашенных образцов белка.) Верховая селезенки ферритина, Б) фрагмент связывания антигена (Fab), С) архейных 20S протеасомы и D) нуклеосом. Все изображения были записаны с тем же увеличением. Шкалы является 20 нм.
Discussion
Отрицательные пятно EM является мощным инструментом, который может быть использован для изучения 3D-структур очищенных образцов белков, таких как использование случайных конической наклона 8 метод, который требует сбора пары изображений с одним из образцов наклонена на 60 ° и один из той же области но untilted, для расчета 3D реконструкции макромолекулярных комплексов. Кроме того, негативные окрашивания EM может иметь множество других приложений, таких как скрининг для двумерной (2D) кристаллов мембранных белков 9, визуализации белковых комплексов в различных конформаций 10, или просто для визуализации однородности и / или неоднородности очищенных белков образца, что позволяет обеспечение обратной связи в целях совершенствования процедур очистки белков и т.д. Он может быть мощным тест для биохимиков. В этой статье мы представили протоколы, начиная от подготовки углерода покрытием сетки для сбора образов негативно окрашенных образцов белка в электронный микроскоп. Как показано здесь,Процедура довольно проста и легко следовать. При попытке вычислить 3D реконструкции образца наблюдается случайными конической метод наклона, необходимо приобрести наклона изображения пары. Однако, если выполнение одного анализа частиц цели, несколько untilted изображения будет достаточно. В обоих случаях дальнейшая обработка изображения не требуется, и это выходит за рамки данной статьи видео.
Как и любой метод, Есть изменения в протоколы. Уранила формиат очень хорошо работает в качестве отрицательного пятна реагента в большинстве случаев. Уранилацетата другой широко используется отрицательная окраска реагента. Она работает очень похожи, как уранила формиат, но с большим размером зерна и, во многих случаях, более низкие, чем контраст уранила формиат. Преимущество использования уранилацетата в том, что решение длится дольше, чем уранила формиат. И не нужно подготовить свежий раствор каждые одну-две недели. Оба формиата и ацетата уранила являются кислыми. Очевидная проблема в том, чтонизкий рН может вызвать изменения в образце белка изучается. Оба пятна решения также функционировать как белка фиксаторов. Ранее исследования показали, что оба образца исправить белок быстро 7. Такая быстрая фиксация делает низкий рН менее важны. В процессе окрашивания, белка образец становится фиксированной до низких рН может вызвать никаких изменений. Тем не менее, другие негативные пятна реагентов, таких как молибдата аммония и фосфорно-вольфрамовой кислоты, может дать лучшие результаты для окрашивания образцов при низких рН обеспокоенность 7. Оба молибдата аммония и фосфорно кислоты примерно нейтральный рН, но контрастность белка образцы порожденных этими пятнами, как правило, уступают уранила формиат.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Электронная микроскопия работы на Cheng лаборатории частично поддержке грантов от NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 и P50GM082250 (А. Френкель)), и грант UCSF Программа Прорыв биомедицинских исследований, возможности премии и Новая премия технологий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
- Cheng, Y., Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).
- Zhou, Z. H. Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Rabl, J. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases. Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).
- Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
- Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).
- Zhao, G. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters. J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).
- Nishida, N. Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations. Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).
