Summary
Visualización de las muestras de proteínas por microscopía de electrones negativos mancha (EM) se ha convertido en un popular método de análisis estructural. Es útil para el análisis estructural cuantitativo, como el cálculo de una reconstrucción en 3D de las moléculas en estudio, y también para el examen cualitativo de la calidad de los preparados de proteínas. En este artículo se presentan los protocolos de detalle para la preparación de las redes de EM, la tinción de la muestra y la visualización de la muestra en un microscopio electrónico. Los usuarios novatos pueden seguir estos protocolos fácil de utilizar y negativas EM mancha como un ensayo de rutina, además de otros ensayos bioquímicos, para evaluar las muestras de proteínas.
Abstract
Microscopía electrónica de una sola partícula (EM), de ambos manchados negativos o congelado muestras biológicas hidratado, se ha convertido en una herramienta versátil en la biología estructural 1. En los últimos años, este método ha logrado un gran éxito en el estudio de las estructuras de las proteínas y complejos macromoleculares 2, 3. En comparación con los electrones criomicroscopía (cryoEM), en el que muestras congeladas de proteína hidratada están incrustados en una fina capa de hielo vítreo 4, tinción negativa es un método de preparación de muestras simples en los que las muestras de proteínas están incrustados en una fina capa de sal seca de metales pesados para aumentar la muestra el contraste 5. El mayor contraste de tinción negativa EM permite el examen de muestras biológicas relativamente pequeño. Además de determinar en tres dimensiones (3D), estructura de proteínas purificadas o complejos de proteínas 6, este método puede ser utilizado para fines mucho más amplios. Por ejemplo, la mancha negativa EM puede ser fácilmente utilizado para visualizar purificadalas muestras de proteínas, la obtención de información tales como la homogeneidad / heterogeneidad de la muestra, la formación de complejos de proteínas o conjuntos de gran tamaño, o simplemente para evaluar la calidad de una preparación de proteínas.
En este artículo, video, se presenta un protocolo completo para el uso de un EM para observar las proteínas de la muestra con tinción negativa, desde la preparación de rejillas recubiertas de carbón para la tinción negativa de EM para la adquisición de imágenes de la muestra con tinción negativa en un microscopio electrónico funciona a un voltaje de aceleración de 120kV. Estos protocolos han sido utilizados en nuestro laboratorio de rutina y pueden ser fácilmente seguidos por los usuarios novatos.
Protocol
1. Preparación de las redes de EM para el revestimiento de carbono
- Llene un vaso grande de vidrio con agua destilada.
- Use una pipeta de vidrio para dejar caer una sola gota de colodión (~ 20μl, el 2% en acetato de amilo, Microscopía Electrónica de Ciencias, PA, EE.UU.) en la superficie del agua. Colodión se extiende para formar una capa delgada de plástico en el agua / aire en la superficie; Nota: A la primera gota de colodión puede ser utilizado para limpiar la superficie del agua de las partículas de polvo. Después de quitar de la película desde la primera gota, la superficie del agua esté libre de polvo.
- Coloque las rejillas EM, 400 o 200 mallas Gilder redes Cu comprado a Ted Pella Inc. (EE.UU.), uno por uno en la capa de plástico que flotan en la superficie del agua, Por lo general, el lugar 50 ~ 100 cuadrículas en un modelo de empaquetamiento compacto, con la brillante lado de la rejilla hacia abajo en la capa de plástico (Fig. 1A). Nota: 400 rejillas de malla son buenos para la rutina de las redes de tinción negativa EM, mientras que 200 redes de malla son buenos para la recopilación de imágenes inclinación par.
- Cortar un pastelce de papel con unas dimensiones ligeramente más grande que el área donde las redes se colocan en la capa de plástico. Coloque el papel con cuidado en la parte superior de la red (Fig. 1B), y esperar hasta que el papel quede totalmente mojado (Fig. 1C). Nota: Los diferentes tipos de papel tienen diferentes tasas de absorción de agua. Es importante que el papel no absorbe el agua muy rápido. Por ejemplo, el papel de filtro normal no es bueno para este propósito, ya que absorbe el agua muy rápido y hace un montón de arrugas. La película de carbono a partir de papel arrugado no es plana, y por lo tanto no es bueno para la recopilación de imágenes inclinación par de azar reconstrucción 3D cónica inclinación. Uno tiene que probar diferentes tipos de papel para encontrar uno adecuado. En nuestro laboratorio, hemos estado utilizando documentos de cuadernos comprados en la tienda local de comestibles. A veces, el papel periódico también fue encontrado para ser adecuado. Otra opción es utilizar el papel relativo de arroz grueso que se utiliza para la caligrafía china / japonesa.
- Rápidamente hacer incisiones en la película de plástico alrededor y cerca deel papel empapado. Inmediatamente después, utilice un par de pinzas para recoger el papel con las rejillas intercalado entre la lámina de plástico y papel. Coloque el papel en una placa de Petri con las rejillas hacia arriba para el secado de aire (Fig. 1D); Nota: Es importante que el papel se seque al aire. De secado muy rápido genera muchas arrugas en el papel.
2. Redes revestimiento de carbono
- La máquina de carbono de revestimiento utilizada en nuestro laboratorio es un Cressington 208C de alto vacío Turbo Coater de carbono (Ted Pella). Nuestro sistema está equipado con un monitor de espesor Cressington película, que mide el espesor de película de carbono recubierto basado en el principio de que la frecuencia de oscilación de un cristal de cuarzo se cambia por la masa de una película depositada sobre su superficie. Sin embargo, el protocolo descrito aquí no es necesario un monitor de espesor, ya que no suele estar disponible en cualquier laboratorio.
- Enfoque de una varilla de carbono con un afilador (Ted Pella) y las barras de carga de carbono en carbono recubrimiento machine (Fig. 2A). Dos barras, una con una punta afilada y la otra con un extremo plano se colocan uno contra el otro.
- La aplicación de grasa de vacío en medio de la zona esmerilada de un portaobjetos de vidrio y ponerla junto a las rejillas (Fig. 2B). Sólo la mitad de la superficie helada de la lámina de vidrio deben estar cubiertos con grasa de vacío. Nota: El área con grasa de vacío no va a cambiar de color después del recubrimiento de carbono. El contraste entre las áreas adyacentes con y sin grasa de vacío proporciona una estimación del espesor de recubrimiento de carbono.
- Coloque el papel con las redes en el escenario de la máquina de carbono de revestimiento. Coloque la lámina de vidrio al lado de las rejillas (Fig. 2C). Nota: También se puede rejillas recubiertas con la primera transferencia de la película de plástico a un portaobjetos de vidrio antes de pintar, en el caso de las redes de muchos se caen desde el papel.
- Bomba de la cámara de vacío, y esperar hasta que el vacío alcanza un nivel de 10 -5 Torr. Nota: revestimiento de vacío con una menor frecuencia genera muchas chispas, lo que resulta de muchas partículas de carbono en grandesla red.
- Incrementar la intensidad muy lentamente. La punta afilada de la varilla de carbono primero se convertirá en rojo y blanco como la corriente aumenta. No ver la punta de alto brillo directamente con el ojo desnudo. Detener el aumento actual cuando el recubrimiento se inicia. La lámina de vidrio cambia de color de blanco a gris claro y gris oscuro. La oscuridad de las diapositivas se relaciona el espesor de la película de carbono que se reviste. Apague el actual para detener el recubrimiento cuando el espesor deseado se ha alcanzado (Fig. 2D). Nota: 1) Después de repetidos procesos de recubrimiento de carbono, carbono revestido desde el interior de la campana de vidrio se puede oscurecer el color. Esto hace que la película de carbono recubierto parece más gruesa de lo que realmente es. 2) Una varilla afilada de carbono puede ser utilizado para el revestimiento de varios. La agudeza de la punta se reduce gradualmente después de cada capa. La corriente máxima está influenciada por la nitidez de la varilla de carbono. Una barra recién afilado con un diámetro más pequeño requiere de un familiar menoractual que se evapore de carbono. Más tarde recubrimiento puede requerir un poco más alta actual.
- De ventilación de la cámara de vacío y quitar rejillas recubiertas para su uso posterior.
Nota 1. El método más exacto para controlar el espesor de carbono mediante el uso de un monitor de espesor de la película. O una cualitativa puede calibrar el color contra el grosor exacto medida por el monitor. Un espesor de carbono útiles para esta técnica es entre 3 y 7 nm.
Este es un método simple y fácil de preparar una gran cantidad de rejillas recubiertas de carbón, por lo general ~ 100 blancos por la preparación. Las rejillas contienen una capa delgada de plástico, que por lo general no afecta a la calidad de la imagen con tinción negativa. Sin embargo, las redes preparadas en este método no son adecuados para cryoEM. Esta capa de plástico pueden ser removidas remojando las rejillas en cloroformo durante varias horas.
3. Preparando la solución de formiato de uranilo (0,75%) para el negativo EM mancha. El protocolo detalladodescrito anteriormente 5
- Pesar 37,5 mg de formato de uranilo en un vaso pequeño;
- Añadir 5 ml de agua hirviendo y revuelva durante 5 minutos en la oscuridad;
- Añadir 10μl 5M NaOH, continuar agitando durante 5 minutos;
- Filtrar la solución con un filtro de jeringa (Fisherbrand, 13mm filtro de jeringa, 0.2μm, Nylon no estériles, número de catálogo 09-720-5), y guarde la solución filtrada en un tubo de 8 ml Falcon cubiertos con papel de aluminio;
Tenga en cuenta. Uranilo polvo formiato se pueden comprar en Ciencias de la Microscopía Electrónica (Hatfield, PA), número de catálogo 22451. Solución de uranilo formato es sensible a la luz y debe mantenerse alejado de la luz directa, por ejemplo, que cubre el tubo Falcon con papel de aluminio. Una solución recién preparada tiene un color amarillo claro (Fig. 3). Solución de la mancha se puede mantener en el banco de una a dos semanas antes de que comience precipitante. Formato de uranilo es ácido con un pH ~ 4. Adición de NaOH aumenta el pH, pero añadiendo lo hace demasiado rápidoo en exceso puede causar la mancha a precipitar. Además de generar el contrario, formato de uranilo también corrige la muestra de proteína. Debido a que la tasa de fijación es tan rápido, el bajo pH por lo general no afecta a las conformaciones de las proteínas en general o la formación de proteínas complejas 7.
4. Protocolo para la preparación de tinción negativa EM red. Este protocolo fue descrito en detalle previamente 5
- Resplandor de descarga de carbón recubierto de cuadrícula, con PELCO easiGlow GlowDischarge sistema (Ted Pella Inc, EE.UU.). La corriente utilizada es de 15 mA y las rejillas son de alta luz durante 30 segundos. Nota. Incandescente de alta redes debe utilizarse poco después de brillar la descarga. A menudo usamos las redes en menos de 2 horas después de la descarga luminiscente.
- Colocar dos gotas de 20μl de agua destilada y dos gotas de 25μl de la solución de formiato de uranilo en un trozo de parafina (Fig. 3B).
- Mantener una alta rejilla que brilla con fuerza inversa-anti-capilar pinzas con el cochebon recubierto hacia arriba. Nota: Es necesario el uso de anti-capilar fórceps. De lo contrario, muestra de líquido sea aspirado lejos de las redes por la fuerza capilar entre las pinzas.
- Aplique la muestra de proteína 2μl a la luz-dado de alta la red, y esperar 30 segundos. Nota: El tiempo de espera y la duración de la descarga luminiscente influir en la concentración de proteínas adsorbidas en la red. Muestras muy diluidas requieren mayores tiempos de adsorción. Sin embargo, la prolongada absorción puede cambiar la concentración de tampón ya los vapores de agua. Para lograr una adecuada distribución de las partículas en la red requiere un poco de prueba y error.
- Mancha de la muestra con papel de filtro.
- Tocar la superficie de la rejilla de una gota de agua y luego seque el agua con papel de filtro. Repita con la segunda caída de agua.
- Tocar la superficie de la rejilla de la primera gota de una breve mancha. Mancha de la solución de la mancha con papel de filtro.
- Tocar la superficie de la rejilla de la segunda caída de la mancha durante 20 segundos. Blot off mancha solución con papel de filtro.
- Seco de la red utilizando una aspiradora. Nota: también se puede salir de las redes en el banco o en una campana química se seque al aire. El beneficio de vacío en seco es que se puede observar las rejillas en el EM de inmediato. El artefacto posibles generados por el secado rápido es desigual mancha.
5. Microscopio electrónico de transmisión
- El microscopio usado en esta demostración es un T12 Tecnai (FEI Company) equipado con una cámara Gatan 4K x 4K CCD.
- En pocas palabras comprobar la alineación del microscopio antes de introducir la muestra; Nota: Esto sólo es necesario una vez por EM sesión. En un microscopio modelo, cerca de la alineación perfecta puede ser guardado anteriormente. Cargando un archivo de tal alineación debe restaurar la alineación microscopio a una condición de perfecto en la zona.
- La carga de la red EM en el único titular de la inclinación de muestra estándar.
- Inserte titular en CompuStage de la T12. Espere a que el ciclo de bombeo para completar.
- Inserte el soporte en la columna. </ Li>
- Enfoque de muestras y establecer un desenfoque deseado, por lo general-1.5um. Nota: El enfoque se puede lograr ya sea de forma manual utilizando el método de enfoque mínimo contraste o el uso de cámaras CCD para capturar imágenes en vivo y en directo el poder calcular espectro de Fourier.
- Grabar una imagen usando la cámara CCD;
- En las imágenes de forma negativa las muestras de proteínas de colores, las proteínas se ven a menudo con un contraste blanco, es decir, la densidad de color blanco sobre un fondo oscuro. Tenga en cuenta que mientras que las concentraciones de proteínas en las diferentes áreas de la misma red suelen ser bastante similares, se hace observar los diferentes niveles de la mancha en las diferentes áreas de la misma red. A veces, áreas podría tener manchas irregulares o incluso una tinción positiva (la proteína se ve oscuro sobre un fondo claro), mientras que otras áreas tienen perfecto mancha. A menudo es necesario buscar la red para localizar una buena zona para la imagen.
6. Resultados representante
Ejemplos típicos de buenas imágenes de forma negativa estacionesmuestras INED, el caballo del bazo ferritina (Figura 4), Fab (Fig. 4B), 20S proteasoma arqueas (Fig. 4C) y nucleosoma (Fig. 4D), se muestran.
Figura 1. Preparación de rejillas recubiertas de carbón para el negativo EM mancha. A) Colocación de rejillas de EM, uno por uno en un patrón de embalaje cerrado en la superficie de la película de colodión. B) Colocar un trozo de papel un poco más grande que el área de las redes. C) Esperar hasta que el papel quede completamente mojado. D) Recoger el documento junto con las rejillas para el secado al aire.
Figura 2. . Recubrimiento de carbono con redes de EM A) la instalación del evaporador de carbono: colocar las dos varillas de carbono en el aparato de revestimiento, con una caña (a la izquierda) afilada a una punta de punto. La varilla de otros (a la derecha) tiene una superficie plana y entrar en contacto con la punta de la punta de la una de la s frente aide. B) Coloque una pequeña cantidad de grasa de vacío en un lado de una lámina de vidrio promovido. El área dentro del marco negro tiene grasa de vacío. C) Configuración de las redes para el recubrimiento. Los portaobjetos de vidrio se utilizan para sostener el papel en su posición. La punta de flecha señala la zona con grasa de vacío. D) Después del recubrimiento, el color de la lámina cubierta con grasa de vacío no cambia el color. El contraste indica el espesor del recubrimiento de carbono.
Figura 3. Ilustra el procedimiento de tinción negativa. A) recién preparado (izquierda), formato de uranilo solución es transparente, sin signo de precipitados. Después de 1 a 2 semanas, precipitados se van acumulando en el fondo en la parte inferior del tubo. B) Colocar dos gotas (~ 25μl) de agua destilada y dos gotas de solución de uranilo formato en un trozo de parafilm. Use un par de pinzas anti-capilar para mantener un brillo de alta carbono recubiertos de malla EM con el lado de carbonoarriba. Una gota de la muestra (~ 2μl) se coloca en la red. C) Después de esperar 30 segundos, secar la solución con un papel de filtro. D) Voltear la red de tocar la parte de la muestra de la red con la primera gota de agua. Repita el paso C y D para completar el proceso de tinción.
Figura 4. Ejemplos de EM imágenes de muestras de proteínas con tinción negativa. A caballo ferritina) el bazo, B) fragmento de unión al antígeno (Fab), C) 20S proteasoma arqueas y D) nucleosoma. Todas las imágenes fueron grabadas con el mismo aumento. La barra de escala es 20 nm.
Discussion
Tinción negativa EM es una poderosa herramienta que puede utilizarse para estudiar las estructuras 3D de las muestras de proteína purificada, como el uso de la inclinación cónica aleatorio de 8 método, que requiere recoger un par de imágenes con una muestra de inclinación de 60 ° y otro de la misma zona pero Untilted, para el cálculo de las reconstrucciones 3D de complejos macromoleculares. Además, la tinción negativa EM pueden tener muchas otras aplicaciones, tales como la detección de dos dimensiones (2D) los cristales de 9 de proteínas de la membrana, la visualización de complejos de proteínas en diferentes conformaciones 10, o simplemente para la visualización de la homogeneidad y / o la heterogeneidad de las proteínas purificadas de la muestra por lo tanto proporcionar retroalimentación para mejorar los procedimientos de purificación de proteínas, etc puede ser un ensayo de gran alcance para los bioquímicos. En este artículo, hemos presentado los protocolos que van desde la preparación de las rejillas recubiertas de carbono a la recogida de imágenes de forma negativa las muestras de proteínas de colores en un microscopio electrónico. Como se muestra aquí,el procedimiento es bastante simple y fácil de seguir. Si ha intentado calcular reconstrucciones en 3D de la muestra se observa por el método aleatorio inclinación cónica, es necesario adquirir imágenes inclinación par. Sin embargo, si se realiza el análisis de partículas individuales es el propósito, múltiples imágenes Untilted será suficiente. En ambos casos, el procesamiento de imágenes se requiere más y esto está fuera del alcance de este artículo de vídeo.
Al igual que con cualquier otro método, hay variaciones en los protocolos. Formato de uranilo funciona muy bien como un reactivo de tinción negativa en la mayoría de los casos. Acetato de uranilo es otro de uso de reactivos tinción negativa. Su funcionamiento es muy similar al formato de uranilo, pero con un tamaño de grano y, en muchos casos, un menor contraste de formato de uranilo. La ventaja de usar acetato de uranilo es que la solución dura más de formato de uranilo. Uno no necesita para preparar una solución fresca cada una o dos semanas. Ambos formato de uranilo y acetato son ácidos. Una preocupación obvia es que elbajo pH puede provocar cambios en la muestra de la proteína en estudio. Ambas soluciones de tinción también funcionan como fijadores de proteínas. Un estudio anterior ha demostrado que tanto las muestras de proteínas arreglar rápidamente 7. Esta fijación rápida hace que el pH bajo es menos importante. Durante el proceso de coloración, una muestra de proteína se fija antes de que el bajo pH puede provocar algún cambio. Sin embargo, otros reactivos de tinción negativa, tales como molibdato de amonio y ácido fosfotúngstico, puede producir mejores resultados para la tinción de las muestras cuando el pH bajo es una preocupación 7. Ambos molibdato de amonio y ácido fosfotúngstico tienen un pH aproximadamente neutro, pero el contraste de muestras de proteínas generadas por estas manchas es generalmente inferior al formato de uranilo.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Trabajos de microscopía electrónica en el laboratorio de Cheng es en parte el apoyo de subvenciones de NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 y P50GM082250 (a A. Frankel)), y una beca del Programa de UCSF de la investigación de vanguardia Biomédica, el Premio de Oportunidades y el Premio Nuevas Tecnologías.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
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