Summary
Campioni di proteine di visualizzazione negativo microscopia elettronica macchia (EM) è diventato un metodo popolare di analisi strutturale. È utile per l'analisi quantitativa strutturale, come ad esempio calcolare una ricostruzione 3D delle molecole in fase di studio, e anche per l'esame qualitativo della qualità della preparazione delle proteine. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per la preparazione delle griglie EM, colorazione del campione e visualizzando il campione in un microscopio elettronico. Gli utenti meno esperti possono seguire questi protocolli in modo semplice e di utilizzare negativo EM macchia come un test di routine, oltre ad altri saggi biochimici, per valutare i loro campioni di proteine.
Abstract
Singolo microscopio elettronico di particelle (EM), sia macchiato negativo o congelati campioni biologici idratata, è diventato uno strumento versatile nel campo della biologia strutturale 1. Negli ultimi anni, questo metodo ha ottenuto grande successo nello studio delle strutture delle proteine e dei complessi macromolecolari 2, 3. Rispetto alle elettroni cryomicroscopy (cryoEM), nella quale sono incorporate congelati campioni di proteine idratata in un sottile strato di ghiaccio vitreo 4, colorazione negativa è più semplice un metodo di preparazione del campione in cui sono incorporati campioni di proteine in un sottile strato di sale essiccato metalli pesanti per aumentare la campione di contrasto 5. Il contrasto maggiore di macchia negativa EM consente l'esame di campioni biologici relativamente piccolo. Oltre a determinare tridimensionali (3D) la struttura di proteine purificate o complessi di proteine 6, questo metodo può essere utilizzato per scopi molto più ampio. Per esempio, macchia negativa EM può essere facilmente utilizzato per visualizzare purificatacampioni di proteine, ottenendo informazioni quali l'omogeneità / eterogeneità del campione, la formazione di complessi proteici o assiemi di grandi dimensioni, o semplicemente per valutare la qualità di un preparato proteico.
In questo articolo il video, vi presentiamo un protocollo completo per utilizzare un EM di osservare campione di proteine negativamente macchiato, dalla preparazione griglie di carbonio rivestiti per negativi macchia EM ad acquisire immagini di campione negativamente macchiato in un microscopio elettronico operato a 120kV tensione di accelerazione. Questi protocolli sono stati utilizzati nel nostro laboratorio di routine e può essere facilmente seguita da nuovi utenti.
Protocol
1. Preparazione di EM griglie per il rivestimento di carbonio
- Riempire un grande bicchiere di vetro con acqua distillata.
- Utilizzare una pipetta di vetro per far cadere una sola goccia di collodio (~ 20μl, 2% in acetato di amile, Scienze della Microscopia Elettronica, PA, USA) sulla superficie dell'acqua. Collodio si diffonderà a formare uno strato sottile di plastica l'acqua / aria di superficie; Nota: Una prima goccia di collodio può essere usato per cancellare la superficie dell'acqua da eventuali particelle di polvere. Dopo la rimozione del film dalla prima goccia, la superficie dell'acqua è chiaro di polvere.
- Luogo EM griglie, 400 o 200 mesh Gilder griglie Cu acquistato da Ted Pella Inc. (USA), uno per uno sul foglio di plastica galleggianti sulla superficie dell'acqua; solito posto 50 ~ 100 griglie in un modello stretto di imballaggio, con il lucido lato della griglia rivolto verso il basso nello strato di plastica (Fig. 1A). Nota: 400 reti mesh sono buone per routine negativo griglie macchia EM; che 200 reti mesh sono buoni per la raccolta di immagini coppia tilt.
- Tagliare una tortace di carta con dimensioni leggermente più grandi rispetto alla zona dove sono poste le griglie sul foglio di plastica. Posizionare la carta con cautela sulla parte superiore della griglia (Fig. 1B), e attendere che la carta diventa completamente bagnato (Fig. 1C). Nota: I tipi di carta diversi hanno diversi tassi di assorbimento d'acqua. E 'importante che la carta non assorbe l'acqua troppo velocemente. Per esempio, regolare carta da filtro non è buono per questo scopo perché assorbe acqua troppo veloce e fa un sacco di rughe. Il film di carbonio in carta arricciata non è piatto, e quindi non buona per la raccolta di immagini coppia inclinazione casuale per la ricostruzione 3D conica tilt. Si deve verificare i documenti diversi per trovare una adatta. Nel nostro laboratorio, abbiamo usato carte da taccuini comprato al negozio locale. A volte la carta di giornale è stata riscontrata anche per essere adatto. Un'altra opzione è quella di utilizzare la carta di riso relativa spessa utilizzata per la calligrafia cinese / giapponese.
- Rapidamente praticare incisioni sulla pellicola di plastica intorno e vicino ala carta imbevuta. Subito dopo, usare un paio di pinze per prendere la carta con le griglie a sandwich tra il film di plastica e carta. Posizionare la carta in una capsula di Petri con le griglie rivolto verso l'alto per l'essiccazione all'aria (Fig. 1D); Nota: è importante lasciare il giornale con aria secca. Asciugatura troppo veloce genera molte rughe sul giornale.
2. Rivestimento in carbonio griglie
- Il carbonio-rivestimento macchina utilizzata nel nostro laboratorio è una Cressington 208C Alto Vuoto Turbo Carbon Coater (Ted Pella). Il nostro sistema è equipaggiato con un monitor Cressington spessore del film, che misura lo spessore del film di carbonio rivestito basa sul principio che la frequenza di oscillazione di un cristallo di quarzo è cambiata la massa di un film depositato sulla sua superficie. Tuttavia, il protocollo qui descritto non richiede un monitor di spessore, dal momento che spesso non è disponibile in ogni laboratorio.
- Affinare una canna in carbonio con un temperamatite (Ted Pella) e barre di carbonio carico rivestimento in carbonio machine (Fig. 2A). Due canne, uno con una punta acuminata e l'altra con un finale piatto sono posti uno contro l'altro.
- L'applicazione di grasso per vuoto a metà della superficie smerigliata di un vetrino e collocarlo accanto alle griglie (Fig. 2B). Solo la metà della superficie smerigliata del vetrino dovrebbe essere coperto con grasso per vuoto. Nota: l'area con grasso vuoto non cambia colore dopo il rivestimento in carbonio. Il contrasto tra le aree adiacenti con e senza grasso per vuoto fornisce una stima dello spessore del carbonio rivestito.
- Posizionare la carta con le griglie sul palco della macchina rivestimento in carbonio. Posizionare il vetrino vicino al griglie (Fig. 2C). Nota: Si può anche griglie primo trasferimento ricoperto con la pellicola di plastica per un vetrino prima del rivestimento, nel caso in cui molte griglie cadere dalla carta.
- Pompa a camera a vuoto, e attendere che il vuoto raggiunge un livello di 10 -5 Torr. Nota: rivestimento con basso vuoto genera spesso molte scintille, risultando a molti grandi particelle di carboniola griglia.
- Aumentare la corrente molto lentamente. La punta affilata della canna di carbonio prima diventare rosso e poi bianco come la corrente aumenta. Non guardare la punta alta luminosità direttamente ad occhio nudo. Fermare l'aumento di corrente quando il rivestimento si avvia. Il vetrino cambia colore dal bianco al grigio chiaro e grigio scuro poi. L'oscurità delle diapositive correla lo spessore del film di carbonio viene rivestito. Spegnere il rivestimento in corso per fermare quando lo spessore desiderato è stato raggiunto (Fig. 2D). Nota: 1) Dopo ripetuti processi di rivestimento in carbonio, il carbonio rivestiti dall'interno della campana di vetro potrebbe oscurare il suo colore. Questo rende il film di carbonio rivestito appaiono più spesso di quanto non sia in realtà. 2) Un asta di carbonio affilata può essere utilizzato per il rivestimento di molti. La nitidezza della punta è gradualmente ridotta dopo ogni rivestimento. La corrente massima è influenzata dalla nitidezza della canna di carbonio. Una canna appena affilato con diametro inferiore richiede un parente minorecorrente per far evaporare carbonio. Più tardi rivestimento può richiedere leggermente superiore in corso.
- Vent la camera a vuoto e rimuovere le griglie rivestito per un uso successivo.
Nota 1. Il metodo più accurato per controllare lo spessore di carbonio è quello di utilizzare un monitor di spessore del film. Oppure si può qualitativamente calibrare il colore contro lo spessore esatto misurata dal monitor. Uno spessore di carbonio utile per questa tecnica è tra 3 e 7 nm.
Questo è un metodo semplice e facile per preparare una grande quantità di griglie di carbonio rivestiti, di solito circa 100 griglie per la preparazione. Le griglie contengono un sottile strato di plastica, che di solito non influisce sulla qualità dell'immagine negativa macchiato. Tuttavia, griglie preparate in questo metodo non sono adatti per cryoEM. Questo strato di plastica può essere rimosso immergendo le griglie in cloroformio per diverse ore.
3. Preparazione formiato soluzione uranile (0,75%) per negativi EM macchia. Il protocollo è stato dettagliatodescritto in precedenza 5
- Pesare 37.5mg di formiato di uranile in un bicchiere piccolo;
- Aggiungere 5 ml di acqua bollente e mescolare per 5 minuti al buio;
- Aggiungere 10μl 5M di NaOH, continuare mescolare per 5 minuti;
- Filtrare la soluzione con una siringa filtro (Fisherbrand, 13mm filtro per siringa, 0.2μm, nylon non sterili, numero di catalogo 09-720-5), e conservare la soluzione filtrata in un tubo Falcon 8ml coperto con un foglio di alluminio;
Nota. Uranile polvere formiato può essere acquistato da Scienze della Microscopia Elettronica (Hatfield, PA), numero di catalogo 22451. Formiato soluzione uranile è sensibile alla luce e deve essere tenuto lontano dalla luce diretta, ad esempio coprendo il tubo Falcon con un foglio di alluminio. Una soluzione preparata di recente ha un colore giallo chiaro (Fig. 3A). Soluzione macchia può essere tenuto in panchina per una o due settimane prima del suo inizio precipitazione. Formiato di uranile è acida con un pH ~ 4. L'aggiunta di NaOH il pH aumenta, ma aggiungendo che troppo in frettao in eccesso può causare la macchia a precipitare. Oltre a generare contrasto, formiato di uranile fissa anche il campione. Perché il tasso di fissazione è così rapida, il basso pH non influenza le conformazioni delle proteine generale o la formazione di proteine complesse 7.
4. Protocollo per la preparazione negativo macchia EM griglia. Questo protocollo è stata descritta nel dettaglio in precedenza 5
- Glow-scarico griglia di carbonio rivestiti, utilizzando PELCO easiGlow GlowDischarge sistema (Ted Pella Inc., USA). La corrente utilizzata è di 15 mA e griglie sono bagliore scarica per 30 sec. Nota. Glow-griglie di scarico deve essere utilizzato subito dopo la luce di scarico. Spesso usiamo le griglie in meno di 2 ore dopo l'glow discharge.
- Mettere due gocce 20μl di acqua distillata e due gocce di soluzione di 25μl uranile formiato su un pezzo di parafilm (Fig. 3B).
- Tenere un bagliore-scarica griglia utilizzando reverse-force anti-capillare pinze con l'autobon rivestite verso l'alto. Nota: è necessario utilizzare anti-capillare pinze. Altrimenti, campione liquido sarà risucchiata dalle reti dalla forza capillare tra le pinze.
- Applicare il campione 2μl proteina per la luce-scarica griglia e attendere per 30 sec. Nota: Il tempo di attesa e la durata della glow discharge influenza la concentrazione di proteine adsorbite nella griglia. Campioni molto diluiti richiedono tempi più lunghi di adsorbimento. Tuttavia, l'assorbimento prolungato può cambiare la concentrazione del tampone dal vapore acqueo. Per raggiungere una corretta distribuzione delle particelle in griglia richiede un po 'di prova e l'approccio di errore.
- Blot fuori l'esempio utilizzando carta da filtro.
- Toccare la superficie della griglia per una goccia d'acqua e poi asciugare l'acqua con carta da filtro. Ripetere con la goccia d'acqua 2.
- Toccare la superficie della griglia per la prima goccia di una breve macchia. Blot fuori la soluzione macchia con carta da filtro.
- Toccare la superficie della griglia per la seconda goccia di colorante per 20 secondi. Blot off soluzione macchia con carta da filtro.
- Asciugare la griglia con un aspirapolvere. Nota: si può anche lasciare le griglie in panchina o in una cappa chimica per asciugare all'aria. Il vantaggio di vuoto a secco è che si possono osservare le griglie in EM immediatamente. L'artefatto possibili generato da una rapida essiccazione è irregolare macchia.
5. Microscopio elettronico a trasmissione
- Il microscopio usato in questa dimostrazione è un T12 Tecnai (FEI Company), dotato di una fotocamera Gatan 4K x 4K CCD.
- Brevemente verificare l'allineamento del microscopio prima di inserire campione; Nota: Questa è necessaria solo una volta per sessione di EM. In un modello di microscopio, un allineamento perfetto può essere salvato in precedenza. Caricamento di un file di allineamento dovrebbe ripristinare l'allineamento microscopio ad una condizione quasi perfetto.
- Caricare la griglia EM nel singolo titolare di inclinazione del campione standard.
- Inserire il supporto nel CompuStage del T12. Attendere che il ciclo di pompaggio per il completamento.
- Inserire il supporto in colonna. </ Li>
- Messa a fuoco del campione e impostare una sfocatura voluta, di solito-1.5um. Nota: messa a fuoco può essere ottenuto sia con messa a fuoco manuale con il metodo del contrasto minimo o con camera CCD per catturare immagini dal vivo e vivere spettro di potenza di calcolo di Fourier.
- Registrare un'immagine con telecamera CCD;
- Nelle immagini di campioni macchiato negativamente le proteine, le proteine sono spesso visti con contrasto bianco, densità cioè bianco su uno sfondo più scuro. Si noti che mentre la concentrazione di proteine in diverse zone della stessa griglia di solito sono abbastanza simili, si fa osservare diversi livelli di macchia in diverse aree della griglia stessa. A volte le zone potrebbe avere macchie irregolari o addirittura colorazione positiva (proteine appare scuro su sfondo chiaro), mentre altre aree sono perfette macchia. Spesso è necessario per cercare la rete per individuare una buona zona per l'imaging.
6. Rappresentante Risultati
Esempi di buone immagini tipiche di negativo stacampioni INED, cavallo milza ferritina (Figura 4A), Fab (Fig. 4B), archaeal proteasoma 20S (Fig. 4C) e nucleosoma (Fig. 4D), sono mostrati.
Figura 1. Preparazione delle griglie di carbonio rivestiti per negativo EM macchia. A) Inserimento EM griglie uno per uno in un modello di imballaggio chiuso sulla superficie del film di collodio. B) Posizionamento di un pezzo di carta leggermente più grande dell'area delle griglie. C) Attendere che la carta viene completamente bagnata. D) Prendete la carta con le griglie per l'aria di essiccazione.
Figura 2. . Rivestimento griglie EM con carbonio A) Imposta l'evaporatore di carbonio: luogo le due barre di carbonio negli apparati di rivestimento, con una sola canna (a sinistra) ad una punta affilata punto. L'asta di altri (a destra) ha una superficie piana ed entrare in contatto con la punta il punto di quello in s di fronte alide. B) Mettete una piccola quantità di grasso vuoto in un lato di un vetrino favorito. L'area all'interno della cornice nera è grasso per vuoto. C) Imposta le griglie per il rivestimento. I vetrini sono usati per tenere la carta in posizione. La freccia indica la zona con grasso per vuoto. D) Dopo il rivestimento, il colore della diapositiva con grasso vuoto coperto non cambia il colore. Il contrasto indica lo spessore del carbonio rivestito.
Figura 3. Illustrando la procedura di colorazione negativa. A) preparata di fresco (a sinistra) soluzione formiato di uranile è trasparente senza segno di precipitati. Dopo 1 ~ 2 settimane, precipitati iniziare ad accumulare in basso nella parte inferiore del tubo. B) Inserire due gocce (~ 25μl) di acqua distillata e due gocce di soluzione di formiato di uranile in un pezzo di parafilm. Usare un paio di anti-capillare pinze per tenere un bagliore scarica carbonio rivestite griglia di EM con il lato di carboniol'alto. Una goccia di campione (~ 2μl) è posto in griglia. C) Dopo aver aspettato per 30 secondi, asciugare la soluzione con un filtro di carta. D) Capovolgere la griglia di toccare il lato campione della griglia con la prima goccia d'acqua. Ripetere il passaggio C e D per completare il processo di colorazione.
Figura 4. Esempi di EM immagini di campioni di proteine negativamente colorati. A) ferritina milza a cavallo, B) frammento di legare l'antigene (Fab), C) archaeal proteasoma 20S e D) nucleosoma. Tutte le immagini sono state registrate con lo stesso ingrandimento. La barra di scala è 20 nm.
Discussion
Negativo macchia EM è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare le strutture 3D di campioni proteina purificata, come l'utilizzo casuale inclinazione conica 8 metodo, che richiede la raccolta di una coppia di immagini con uno da campione inclinato a 60 ° e uno dalla stessa area ma Untilted, per calcolare ricostruzioni 3D di complessi macromolecolari. Inoltre, colorazione negativa EM può avere molte altre applicazioni, come ad esempio screening per bidimensionali (2D) i cristalli di proteine di membrana 9, visualizzando complessi proteici in diverse conformazioni 10, o semplicemente per visualizzare omogeneità e / o eterogeneità del campione di proteine purificate così fornendo feedback di migliorare le procedure di purificazione di proteine, ecc Si può essere un test efficace per biochimici. In questo articolo, abbiamo presentato i protocolli che vanno dalla preparazione del carbonio rivestite griglie di raccolta di immagini di campioni di proteine negativamente colorati in un microscopio elettronico. Come illustrato qui,la procedura è piuttosto semplice e facile da seguire. Se si tenta di calcolare ricostruzioni 3D del campione viene osservato da casuali metodo inclinazione conica, è necessario acquisire immagini coppia tilt. Tuttavia, se l'esecuzione di analisi singola particella è lo scopo, più immagini Untilted sarà sufficiente. In entrambi i casi, l'elaborazione delle immagini è necessario un ulteriore e questo va oltre lo scopo di questo articolo video.
Come con qualsiasi metodo, ci sono variazioni ai protocolli. Formiato di uranile funziona molto bene come reagente negativo macchia nella maggior parte dei casi. Acetato di uranile è un altro comunemente usato reagente negativo macchia. Funziona molto simile come formiato di uranile, ma con una granulometria maggiore e, in molti casi, inferiori contrasto rispetto a formiato di uranile. Il vantaggio di utilizzare acetato di uranile è che la soluzione dura più di formiato di uranile. Non c'è bisogno di preparare una soluzione fresca ogni una o due settimane. Sia formiato e acetato di uranile sono acide. Una preoccupazione ovvia è che ilpH basso potrebbe indurre cambiamenti nel campione di proteine oggetto di studio. Entrambe le soluzioni macchia anche funzionare come fissativi proteine. Uno studio precedente ha dimostrato che entrambi i campioni di proteine fissare rapidamente 7. Questo fissaggio rapido rende il basso pH meno importanti. Durante il processo di colorazione, un campione di proteina si fissa prima il pH basso può indurre le eventuali modifiche. Tuttavia, altri reagenti negativi macchia, come molibdato di ammonio e acido fosfotungstico, possono dare risultati migliori per la colorazione dei campioni quando il pH basso è un problema 7. Sia molibdato di ammonio e acido fosfotungstico avere un pH circa neutro, ma il contrasto di campioni di proteina generata da queste macchie è di solito inferiore a formiato di uranile.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Microscopia elettronica a Cheng lavoro di laboratorio è in parte il supporto anche da finanziamenti NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 e P50GM082250 (A. Frankel)), e una borsa di studio UCSF Programma di Ricerca Biomedica Breakthrough, Premio Opportunità e New Technology Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
- Cheng, Y., Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).
- Zhou, Z. H. Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Rabl, J. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases. Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).
- Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
- Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).
- Zhao, G. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters. J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).
- Nishida, N. Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations. Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).
