在感染过程中,一个关键的步骤是病原体与宿主细胞的粘附。在大多数情况下,粘附步骤发生在流动的液体所产生的机械应力的存在。我们描述了一种技术,细菌粘附的研究中的一个重要参数引入剪应力。
在细菌感染的病原体及其宿主之间发生的相互作用序列。细菌粘附到宿主细胞表面往往是最初的发病机制和步骤。虽然大多在静态条件下研究实验附着力附着力实际上是在流动的液体的存在。细菌和他们的主人之间的第一次接触,经常会出现水平的粘膜,口腔,肺,肠,眼,等上皮细胞表面的粘液沿流动。后来,在感染,病原体偶尔访问的血液循环,导致危及生命的疾病,如败血症,败血症和脑膜炎。这些感染的一个定义特征是这些病原体与血管内皮细胞在血液循环的存在交互能力。流动的液体,粘液或血液,例如存在,决定粘连,因为它会产生对病原体的机械力。为了描述流动的液体之一的效果通常是指剪应力,这是一个固定的墙附近的一个移动流体,达因/厘米2表示每单位面积所施加的切向力的概念。剪应力强度有很大的不同根据不同船只的类型,大小,器官,位置等(0-100达因/厘米2)。毛细血管的循环,可以达到非常低的剪应力值,甚至暂时停止期,在几秒钟之间到几分钟1的。在频谱剪应力在动脉的另一端,可以达到100达因/厘米2。剪应力在不同的生物过程的影响已清楚地表明,例如在白细胞与内皮细胞的3的相互作用。要考虑到这种细菌粘附过程中的机械参数,我们利用了基于4室使用一次性流的实验过程。宿主细胞是生长在流室,荧光细菌注射泵控制流量介绍。我们最初集中在细菌病原体脑膜炎奈瑟菌 ,革兰氏阴性菌败血症和脑膜炎等负责调查。这里描述的步骤,使我们能够研究细菌的能力的剪应力的影响:坚持细胞1列,增殖和细胞表面上的5 分离殖民6(图1)新的站点。补充的技术资料中可以找到参考文献7。这里介绍的剪应力值分别为选择基于我们以往的经验,并表示在文献中找到的值。该协议应适用于广泛的病原体根据研究目标的具体调整。
剪应力,一般在生物力学方面的重要性正日益被人们所认识。例如高度适应胶粘剂的选择素家族的蛋白质在细胞粘附和血管壁的滚动过程中已确认的过程中通过引入剪应力。上文所述的程序,适用于革兰氏阴性菌的脑膜炎奈瑟菌,但应适用于广泛的病原体。也为其他病原体和其他感染部位的剪应力的重要性已被证明。细菌粘附剪应力的条件下已经FimH黏附研究发现肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC) 9。类似选择素,被证明是由剪切引起的机械力和CfaE 肠毒素大肠杆菌黏附加强FimH和其宿主细胞受体之间的相互作用也有报道调解肠上皮细胞的粘附,通过剪切依赖性机制10。我们报道,使用的层流室,无乳链球菌菌毛为流动条件下的上皮细胞 11坚持这种病菌是至关重要的本章中描述的实验协议。这些研究证实,我们的流室法是一个有用的工具,调查宿主细胞病原体相互作用的剪应力条件下。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢爱米丽Mairey和灵光Donnadieu程序的初始设置。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 |
Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | Becton Dickinson | 300865 |
Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher-Scientific | R3603 |
3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 |
Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 |
Inverted microscope, Nikon | Nikon | Eclipse Ti |
CCD camera | Hamamatsu | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD |
ImageJ software | NIH | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |