Summary
Во время инфекционного процесса, что является ключевым шагом является адгезии патогенов с клетками хозяина. В большинстве случаев этот шаг адгезии происходит при наличии механических напряжений порожденных течет жидкость. Мы описываем технику, которая вводит напряжения сдвига в качестве важного параметра для исследования бактериальной адгезии.
Protocol
1. Человек клетки-хозяина и бактериальной культуры
- Культура HUVECs между прохождением 1 и 9 при 37 ° во влажной инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2. Прохождение клеток, когда они приближаются к 80% слияния с трипсин / ЭДТА по содержанию культур на 75 см 2 колбах культуры и экспериментальных культур в одноразовых камерах потока (μ-Слайды VI).
- Вывод среды из колб для пассировать, мыть клетки с 10 мл PBS, отозвать и заменить его на 1,5 мл трипсин / ЭДТА. Разрешить клетки отделить в культуре клеток инкубаторе в течение 5 минут при температуре 37 ° C.
- Сбор клеток с 10 мл клеточной среде культуры в 15 трубке коллекции мл. Гранул клеток с 5 минут центрифугирования (на 200 г), при комнатной температуре. Приостановить клетки в 4 мл Эндо-SFM с добавлением 10% (объем / объем) FBS и считать их на камеру Malassez, в соответствии с инструкциями производителя.
- Ввести 30 мкл 1x10 6 HUVEC клеток на мл суспензии в канале (3x10 4 общего числа) и позволяют клеткам придерживаться в течение 3 часов при температуре 37 ° во влажной инкубатор атмосфере 5% (объем / объем) CO 2. Добавить дополнительный объем 120 мкл Эндо-SFM для заполнения скважин. Клетки должны стать subconfluent монослоя (рис. 2).
- Расти Н. meningitidis выражения GFP (в этом случае напряжение 8013 выражения GFP под контролем IPTG индуцируемый промотор), на GCB пластин агара, содержащего добавки Kellogg и 5 мкг / мл хлорамфеникола при 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% (об. / г) CO 2 в течение 16 часов.
2. Первоначальная адгезия отдельные бактерии к клеткам хозяина
- Отрегулируйте концентрацию бактерий, выращенных на пластинах GCB агар для OD600 в 0,05 с подогретого Эндо-SFM, содержащей 10% (объем / объем) FBS и инкубировать в течение 120 минут при температуре 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% (об. / г) CO 2, при легком встряхивании (130 оборотов в минуту). Вызвать GFP выражение добавлением 1 мМ IPTG в питательной среде в течение всего периода инкубации.
- Место одноразовые μ-Slide на сцене инвертированный микроскоп оснащен подогревом платформы для поддержания температуры образца при 37 ° C.
- Налейте подогретого Эндо-SFM с добавлением 2% (объем / объем) FBS в стерильный стакан стекло и заполняют 50 мл стерильного шприца с этой средой. Прикрепить "вступления" НКТ шприц и заполнить путем введения среды.
- Подключить «входа» трубки к μ-Slide, с осторожностью, чтобы избежать введения воздуха в камере. Затем прикрепить "выход" трубки на другом конце и тщательно заполнить канал со средним и примерно 1 см от камеры «выход».
- Мера бактериальных OD600 и приспосабливаться к 0.15 в Эндо-SFM, содержащей 2% (объем / объем) FBS. Для того, чтобы смотреть на отдельные бактерии, любые агрегаты должны быть нарушен энергичным вортексе бактериальной образца.
- Разместить 100 мкл Эндо-SFM с добавлением 2% (объем / объем) FBS среды в резервуаре и добавить 100 мкл бактериальной решения взяты из верхней части встряхивали решение, чтобы избежать выборки оставшиеся бактериальных агрегатов.
- Осторожно ввести 200 мкл в μ-Slide, повернув кран для введения бактерий в камере.
- Ввести Эндо-SFM, содержащей 2% (объем / объем) FBS, поддерживается на уровне 37 ° С с подогревом платформы, в камеру при помощи шприца насос с напряжением сдвига совместимы с адгезию 0,044 дин / см 2 в течение 15 минут.
См., например, видео 1 или рисунке 3. После этого шага, либо переехать в разделах 3, 4 или 6.
3. Количественная оценка начальной адгезии отдельные бактерии к клеткам хозяина
- После начальной адгезии в течение 15 минут, как получить изображения из десяти полей случайно в то время как жидкость по-прежнему циркулирует.
- Анализ полученных изображений использованием программного обеспечения ImageJ 8, чтобы получить доступ к среднему числу adherant бактерий на поле. Это делается следующим образом: во-первых, каждое изображение thresholded использовании "Порог" окно, найденное в "Изображение" меню, чтобы выделить отдельные придерживаясь люминесцентные бактерии, минимизируя при этом фоне из клеток. Затем, каждую бактерию считается, с помощью Plug-In "Cell Counter" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Данные для каждого изображения представлены в таблице Excel и усредняются количественно среднее число бактерий приверженцем на поле.
4. Измерение сопротивления потоку отдельных бактерий приверженцем к клеткам хозяина
- Программа шприцевой насос настройки для создания напряжения сдвига в пределах от 3 до 100 дин / см 2 в течение 5 минут.
- В конце 5 минут, приобрести десять полей случайно выбранных, как описано в пункте 3.1, но с потоком остановился пр.IOR с приобретением.
- Анализ полученных изображений, как описано в пункте 3.2 и количественно среднее число оставшихся бактерий на поле.
5. Измерение роста изолированных приверженцем бактерии микроколония
- Ввести Эндо-SFM, содержащей 10% (объем / объем) FBS, поддерживается на уровне 37 ° С с подогревом платформы, в камеру при помощи шприца насос с выбранным напряжением сдвига на несколько часов. Запись изображений для видео в реальном времени микроскопии на один кадр каждые 5 минут.
- После видео-микроскопии, остановить касательное напряжение, отключив шприцевой насос, приобретают 2-3 дополнительных изображений, а затем остановить последовательность получения изображения на программное обеспечение. Например бактериального распространения можно увидеть на видео 2.
6. Измерение сопротивления потоку приверженцем бактериальных микроколоний
- После формирования крупных микроколоний на клеточной поверхности (step5.2) приобретают 2-3 образы обеих ячейках (по фазового контраста) и бактерий (по GFP-флуоресценции) перед потоком приложения. Для остальной части эксперимента, приобретение протокол будет следить только флуоресценции.
- Применение высоких касательное напряжение в течение 5 минут (3-100 дин / см 2) и запись изображений на один кадр каждые 5 секунд.
- Стоп напряжения сдвига, отключив шприцевой насос, приобретают 2-3 дополнительных изображений, а затем остановить последовательность получения изображения на программное обеспечение.
- Затем удалите "выход" трубы первого и осторожно, чтобы избежать опорожнения канала, а затем добавить подогретого свежей средой для заполнения скважины, прежде чем снимать "вступления" трубок.
- Чтобы количественно определить влияние касательное напряжение на бактериальной резистентности, покрытие анализ может быть выполнен следующим образом: собирать оставшиеся средних и мыть μ-Slide в два раза с 120 мкл PBS, который удаляет оставшиеся среды из канала (как моет являются Также собраны).
- Отсоедините инфицированных клеток с добавлением 50 мкл трипсин / ЭДТА в течение 5 минут при 37 ° и смешать это отдельный образец с подвеской, собранных в предыдущем шаге.
- Выполните серийные разведения в PBS и пластиной 10 мкл долю на тарелки GCB агар, в трех экземплярах, в целях определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на следующий день, после инкубации пластин при 37 ° C в инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2.
Видео 3 и 4 сравнить дикого типа с pilV мутанта.
7. Бактериальные отрыв от микроколоний
- Инфицировать клетки в проточную камеру, повторив шаги 2,1 до 2,8 и позволяют инфекции проводили в течение 30 минут.
- Удаление несвязанных бактерий за счет увеличения потока до 10 дин / см 2 в течение 2 минут и дайте инфекции продолжаться в течение 2 часов.
- Сокращение потока до 0,15 дин / см 2.
- Каждый час, собирать капли среду выходит из потока камеры.
- Выполните серийные разведения образцов и пластины их на тарелки GCB агара.
- Определить количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на следующий день, после инкубации пластин при 37 ° C в инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2.
8. Представитель результаты
Рисунок 1: Различные шаги сотовой монослоя, которые можно наблюдать и измерять в присутствии потока в порядке.
Рисунок 2: Эндотелиальная монослоя ячейку в проточную камеру в начале эксперимента (отсутствие напряжения сдвига). Около 50 эндотелиальных клеток организованы в суб-сливающийся монослой.
Рисунок 3: Графическое представление начальную адгезию бактерий на клеточной поверхности. Значения для трех полей указаны, чтобы дать представление о поле до изменения поля, которые, как ожидается, (0044 дин / см 2).
Видео 1. Визуализация начальную адгезию бактерий на клеточном монослое как функция времени (0044 дин / см 2). GFP-экспрессирующих бактерии следующие направления текущей среде. Фильм ускоряется в 60 раз, реальная длительность видео составляет 10 минут.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.
Видео 2. После начальной адгезии бактерий было позволено распространяться на клеточной поверхности в течение 7 часов (ускоренное 1000-кратное).
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.
Видео 3. После распространения на клеточной поверхности механикдр. сопротивление микроколоний была проверена путем увеличения сдвига уровня напряжения до 10 дин / см 2 в течение 5 минут, но дикие микроколоний типа устойчивы ускоренной в 60 раз.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.
Видео 4. Микроколонии образована pilV мутант нарушается потоком увеличение (10 дин / см 2). Этот мутант не может вызвать реконструкция плазматической мембраны под микроколоний и, следовательно, более высокую чувствительность к увеличению напряжения сдвига (видео ускоряется в 60 раз) 5.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.
Discussion
Значение напряжения сдвига и, как правило механических аспектов в биологии получает все большее признание. Например высоко адаптирована адгезивные свойства селектина семейство белков в процессе адгезии лимфоцитов и катались по сосудистой стенки был признан введения напряжения сдвига в процессе. Описанная выше процедура была применена к грам-отрицательные бактерии Neisseria meningitidis, но должны быть применимы к широкому спектру патогенных микроорганизмов. Значение напряжения сдвига было показано и для других патогенных микроорганизмов и других сайтах инфекции. Бактериальная адгезия обусловлена напряжения сдвига было описано изучение FimH адгезина найти на уропатогенных кишечная палочка (УПЭК) 9. Как и в селектины, взаимодействие между FimH и его хозяина клеточного рецептора было показано, что подкрепляется сдвига вызванного механическими силами 9 и CfaE адгезина из энтеротоксигенной E.coli Сообщалось также посредничать адгезией к кишечных эпителиальных клеток с помощью сдвига зависит от механизм 10. Мы сообщали, с использованием ламинарного потока камера анализа протокол, описанный в этой главе, Streptococcus agalactiae пили имеют важное значение для соблюдения этого возбудителя к эпителиальным клеткам в проточных условиях 11. Такие исследования подтверждают, что наши проточную камеру анализ является полезным инструментом для исследования клетки-хозяина и возбудителем взаимодействия в условиях напряжение сдвига.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Эмили Mairey и Эммануэль Донадье для первоначального создания процедуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
- Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Design Principles of Vascular Beds. Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
- Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
- Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
- Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
- Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
- Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).
