Under infektionen processen är ett viktigt steg vidhäftning av patogener med värdceller. I de flesta fall denna anslutning steget sker i närvaro av mekanisk påverkan som genereras av flytande vätska. Vi beskriver en teknik som introducerar skjuvspänningen som en viktig parameter i studien av bakteriell vidhäftning.
Under bakteriella infektioner en sekvens av interaktioner sker mellan patogen och värd. Bakteriell vidhäftning till värdcellen ytan är ofta det första och avgörande steg i patogenes. Trots att experimentellt vidhäftning oftast studeras i statiska förhållanden vidhäftning faktiskt äger rum i närvaro av flytande vätska. Första mötet mellan bakterier och deras värd förekommer ofta på slemhinnor nivå, mun, lungor, tarm, ögon, etc. där slem flyter längs ytan av epitelceller. Senare på infektion, patogener tillgång ibland blodcirkulationen orsakar livshotande sjukdomar som blodförgiftning, sepsis och hjärnhinneinflammation. Ett utmärkande drag för dessa infektioner är möjligheten för dessa patogener att samverka med endotelcellerna i närvaro av cirkulerande blod. Förekomsten av flytande vätska, slem eller blod till exempel bestämmer anslutning eftersom det genererar en mekanisk kraft patogenen. Att karaktärisera effekten av flytande vätska brukar man refererar till begreppet skjuvspänningen, som är den tangentiella kraft som verkar per ytenhet av en vätska som rör sig nära en stationär vägg, uttryckt i dynes / cm 2. Intensitet skjuvspänningen varierar mycket beroende på de olika fartygen typ, storlek, orgel, plats mm (0-100 dynes / cm 2). Cirkulationen i kapillärerna kan nå mycket låga värden skjuvspänningen och även tillfälligt stopp under perioder på mellan några sekunder till flera minuter 1. På andra änden av skalan skjuvspänningen i arterioler kan nå 100 dynes / cm 2 2. Effekten av skjuvspänningen på olika biologiska processer har tydligt visat som till exempel under interaktionen av leukocyter med endotelet 3. Att ta hänsyn till detta mekaniska parameter i den process av bakteriell vidhäftning vi utnyttjat en experimentell som bygger på användning av en disponibel flöde kammare 4. Host celler odlas i flödet kammaren och fluorescerande bakterier införs i flödet styrs av en sprutpump. Vi fokuserade initialt våra undersökningar på bakteriell patogen Neisseria meningitidis, en Gram-negativ bakterie som ansvarar för blodförgiftning och hjärnhinneinflammation. Det förfarande som beskrivs här tillät oss att undersöka effekterna av skjuvspänningen på förmågan hos bakterierna att: ansluta sig till celler 1, att föröka sig på cellytan 5 och lösgöra att kolonisera nya platser 6 (figur 1). Kompletterande teknisk information finns i referens 7. Skjuvspänningen värden som redovisas här valdes utifrån våra tidigare erfarenheter 1 och för att representera värden som finns i litteraturen. Protokollet bör tillämpas på ett brett spektrum av patogener med vissa justeringar beroende på målen för studien.
Vikten av skjuvspänningen och i allmänhet av mekaniska aspekter i biologi i allt större utsträckning erkänt. Till exempel den mycket anpassat självhäftande egenskaper selektin familj av proteiner i processen av lymfocyter vidhäftning och rullar på kärlväggen har erkänts genom att införa skjuvspänning i processen. Det förfarande som beskrivs ovan tillämpades på gramnegativa bakterier Neisseria meningitidis, men bör vara tillämplig på ett brett spektrum av patogener. Vikten av skjuvspänningen har visats även för andra patogener och andra webbplatser infektion. Bakteriell vidhäftning beroende av skjuvspänningen har beskrivits i studien av FimH adhesin finns på uropathogenic Escherichia coli (UPEC) 9. Liknande Selectins var samspelet mellan FimH och dess värdcell receptor visat sig vara stärkas genom skjuvning-inducerad mekaniska krafter 9 och CfaE adhesin av enterotoxinbildande E. coli har rapporterats även att medla vidhäftning till tarmens epitelceller via en sax-beroende mekanism 10. Vi rapporterade, med hjälp av laminärt flöde protokoll kammare analys beskrivs i detta kapitel att Streptococcus agalactiae pili var viktiga för efterlevnad av denna patogen till epitelceller i flöde 11. Sådana studier bekräftar att vårt flöde kammare analysen är ett användbart verktyg för att undersöka värdcellen-patogen interaktioner under förhållanden med skjuvspänning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Emilie Mairey och Emmanuel Donnadieu för den inledande inrättandet av förfarandet.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 |
Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | Becton Dickinson | 300865 |
Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher-Scientific | R3603 |
3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 |
Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 |
Inverted microscope, Nikon | Nikon | Eclipse Ti |
CCD camera | Hamamatsu | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD |
ImageJ software | NIH | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |