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Summary
从大脑标本制备连续切片成像，用刀口扫描显微镜，数据可视化和分析的全过程描述。这项技术是目前用于收购鼠脑数据，但它是适用于其他器官，其他物种。
Abstract
在高通量，高分辨率，三维显微技术的重大进展，使大量的亚微米分辨率的神经解剖数据的采集。刀口扫描显微镜（KESM）7，5，9，在作者的实验室开发和托管的生产规模的全脑数据的第一个这样的工具之一是。 KESM已被用于部分，并在亚微米分辨率的整体形象老鼠大脑，揭示神经元网络的错综复杂的细节（高尔基）1，4，8，血管网络（印度墨水）1，4，和细胞体内的分布（尼氏） 3 。 KESM使用不仅限于鼠标，也没有大脑。我们已经成功地成像章鱼大脑，小鼠肺，和大鼠脑组织。我们目前正在对整个斑马鱼的胚胎。这些数据可以极大地促进connectomics研究10，改善微循环和血流动力学研究;和体视学研究由provi丁一个确切的地面实况。
在这篇文章中，我们将描述的管道，包括样品制备（固定，染色，和嵌入），KESM配置和设置，切片和成像的KESM，图像处理，数据准备，数据可视化和分析。重点将样品制备和可视化/获得的KESM数据进行分析。我们期望在这篇文章中提出详细的协议，以帮助扩大的访问KESM，并提高其利用率。
Protocol
1。试样准备：高尔基 - 考克斯
- 紧随该协议的协议。Mayerich等7。
- 的C57BL/6J小鼠深深麻醉用异氟醚吸入麻醉，然后断头。
- 大脑中删除，并放入一个高尔基考克斯固定的解决方案（1％铬酸钾，1％重铬酸钾，去离子水和1％的升汞）。
- 大脑是留在黑暗中的高尔基体考克斯解决方案，在室温，10至16周。
- 大脑在黑暗中过夜去离子水冲洗。
- 沉浸在铵去离子水在室温下，在黑暗中为7至10天5％的氢氧化钠溶液冲洗大脑。这个漫长的准备时间，以确保整个大脑的渗透，使黑色沉淀物有机会在组织完全形成。
- 大脑是在去离子水冲洗干净，再在室温为4小时和T母鸡通过乙基醇梯度脱水：50％和70％的冰箱（4℃），和85％，95％（3变化），和100％（4至5变化）在室温下。大脑是留在每24小时的解决方案。
- 然后把脱水的大脑是在丙酮（3至4的变化，每一天），牢牢丙酮比为1:2，1:1，2:1，终于在丙酮100％的牢（3变化，每次通宵），在冰箱中，（4℃ ）。
- 最后，处理后的大脑是嵌入在100％牢，并加热至60 ° C，连续3天（参见2雅培和Sotelo嵌入协议）。
如果标本在LR白嵌入式然后通过三个转变LR白色的解决方案，均在冰箱过夜，这是一个标准程序聚合前的标本是从过去的100％的乙醇溶液转移。完成三个转变，以确保充分浸润。标本是T母鸡转移到新鲜LR的白色聚合在一个密闭容器中，在60 ° C为24小时，这是正确的聚合所需的时间和温度。 - 图图1显示了高尔基体考克斯染色脑嵌入在环氧树脂。
- 固化后的试样块，然后安装在金属试样用环氧环，块的两侧，作为必要的修剪（见图2）。
2。试样制备：尼斯尔
- 鼠标是深深使用氯胺酮和甲苯噻嗪（1.7毫克氯胺酮/甲苯噻嗪0.26毫克每20克体重）腹腔注射麻醉，然后用50毫升室温灌注transcardially磷酸盐缓冲液（pH值7.4），250毫升的空间温度10％的中性福尔马林缓冲液（pH值7.4）。最后用3.0毫升未经稀释的印度墨水。
- 全身灌注生理盐水和固定液是必要的，以清除血液和心血管系统的修复的TI ssues。印度墨汁灌注是必要的，完全填补了心血管系统的血管。
- 通过一系列分级乙基醇（25％-100％）造成的大脑，然后脱水，然后在牢塑料嵌入在1.8-1.9以上的协议。如果LR白了就是包埋剂，然后在1.10以上的协议是其次。
4。试样制备：通用品种，一般机关
- 一般情况下，可以用固定为10％中性缓冲福尔马林或4％多聚甲醛。
- 对于小型组织卷，而不是灌注扩散，建议固定和染色。在小生物体或器官的情况下，染色也可以做到在脱水过程中。
- 嵌入协议是与上面相同，解决方案渗透的时代，虽然可以减少器官或生物体，比整个鼠脑小。
- 关闭泵，打开舞台上，打开相机，打开照明灯。
- 提高刀和客观。
- 安装试样环。
- 测量试样的尺寸和KESM阶段Controller2应用程序创建一个配置文件。
- 开始KESM阶段Controller2和初始化阶段。
- 下刀/目标，打开泵。
- 焦点目标和摄像头，眼镜直通车转动调焦旋钮，调整摄像机的视野相对刀刃。
- 按[返回]发起成像。
- 参见图。 3-8。见9的技术细节，7。
6。图像处理和数据准备
- KESM栈处理器可执行文件复制到数据文件夹下的配置文件的文件夹（00000，00001等）。
- KESM栈处理器运行删除照明神器和正常化的背景强度图像。重复子文件夹中的所有数据。
- 准备从数据多尺度瓷砖设置和KESM脑Atlas的Web服务器中的文件上传，并成立。
- 见图。 9。
7。数据可视化和分析
- 使用KESM脑图谱的可视化。转到http://kesm.cs.tamu.edu ，并选择适当的地图集。
- 在谷歌地图导航。
- 在谷歌地图的放大和缩小。
- 要进入到一个不同的深度，选择从下拉菜单中的每一步有多深，然后点击或者[+]或[ - ]增加或减少Z深度。
- 通过使用下拉菜单调整叠加数量。
- 通过使用下拉菜单调整覆盖的时间间隔。
- 见图。 11。
- 可视化使用MeVisLab。
- 启动MeVisLab。
- 创建一个新项目。
- 在下面的，新的模块，可以创建由Ty平安在命令中的模块名称。
- 创建模块[Compose3Dfrom2DFiles]，并转到所需的文件夹。输入文件中的字符串，然后单击[GetFileList]。确保选定的图像可以容纳在内存。点击[Create3D]创建卷。
- 创建模块[SetWorldMatrix]，并设置下的“刻度”“初等变换”X，Y，Z适当的体素大小（0.6，0.7，1.0 10X 0.45NA目标）。链接[Compose3Dfrom2DFiles]至[SetWorldMatrix]。
- 集矩阵和变换“基质组成”下“忽略”，“忽略”，“前进”。
- 创建模块[Arithmetic1]，并设置“功能”，“反转（最大图）”。
链接[SetWorldMatrix]至[Arithmetic1]。 - [View3D创建模块和连接[Arithmetic1]。
- View3D，同时按下鼠标右键，移动鼠标左右调整门槛。您可以裁剪区域，改变方向（移动鼠标的同时按下鼠标左键），改变照明（体积rendering或MIP），开启/关闭背景等。
- 见图。 10。
8。代表性的成果：
在这里，我们目前全脑的数据和细节。图。 12-15显示全脑墨汁，高尔基，和尼氏数据集1，4，3。
图1固定，染色和嵌入式的小鼠大脑 。
图2嵌入式鼠脑标本安装在试样环。
图3。刀刃扫描显微镜（KESM）。 KESM的照片显示标明其主要成分：（1）高速线扫描相机，（2）显微镜的物镜，（3）钻石刀大会和光准直器，（4）SPEcimen罐（水浸泡成像），（5）三轴高精度空气轴承阶段，（6）白光显微镜照明，（7）水泵去除切片组织（回），（8） PC服务器阶段控制和图像采集，（9）花岗岩基座，和（10）花岗岩桥。
图4。KESM的成像原理。 KESM操作主要是说明。目标和刀在地方举行，而标本的定位阶段动作（实线箭头），在分辨率为20 nm和旅行速度的1-5贴，并获得对钻石刀刮掉（5毫米宽10X的目标），生成一个薄片，流经刀（实线箭头）。行扫描成像是附近的刀很尖。
图5KESM相机和目标的重点控制。
图6。KESM刀大会和控制。
图7。初步通过观察口为重点。
图8。KESM级控制器应用程序（截图）。
图9。KESM栈处理器的应用程序（截图）。
图10。MeVisLab应用程序（截图）。
图11。KESM大脑图谱：Web界面（截图）。
图12。KESM全脑墨汁数据。 KESM数据栈卷可视化显示血管的数据集。 （ 一 ）特写血管的数据。宽度〜100 UM。 （BD）三个标准的意见，整个鼠脑血管（高分辨率数据的子采样）。宽度〜10mm的。
图13。KESM全脑鼠标高尔基数据。
图14。KESM高尔基数据的详细信息。
图15。KESM全脑尼氏数据。 （ 一 ）特写了NISSL数据。 〜300 UM 3。 （BD）三个标准的意见，整个鼠脑尼氏数据（高分辨率数据的子采样）。横截面所示的内部结构的一个明确的说法。
Discussion
KESM允许了大量的生物标本（〜1厘米3）亚微米级的调查。这种卷到足以容纳整个小动物的器官，如大脑，肺，心脏，肾脏，，等等等器官的图像扫描，可以提供前所未有的定量信息，对这些器官的组织结构和启用各种功能的计算模型这些器官的各个方面，包括电路和网络动力学，电学性能，流体和空气流体动力学，以及肌肉动力学。
在这篇文章中详细的样品制备协议和事后分析协议，预计将有助于研究小组以外KESM产生的数据更容易获得。 KESM操作的协议将有助于这些外部研究人员欣赏这种独特的成像方式的好处和限制。
Disclosures
托德霍夫曼是3Scan，一家商业公司，生产和销售的KESM技术（美国专利＃6744572）。
Acknowledgments
该项目是由美国国立卫生研究院/ NINDS（＃1R01 - NS54252），NSF（＃0905041，＃0079874），得克萨斯州的先进技术计划（ATP - 000512 - 0146 - 2001，＃ATP - 000512 - 0261 - 2001），得克萨斯州A和中号研究基金会，大学计算机科学与工程在得克萨斯A＆M大学和3Scan系。我们想感谢陈智思梅萨（科技之星技术）KESM仪器的技术咨询和支持。的设计和实施KESM的主要部分是由Bruce H.麦考密克，在2007年去世。
References
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- Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
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- Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).
Tags
生物工程，58期，物理切片，连续切片，光镜，脑成像，切片Erratum
Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 04/07/2013.
Citeable Link.
A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. The Nissl staining protocol was modified from:
2. Specimen preparation: Nissl
- The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
- Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
- The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
- The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
- Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
- The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
- The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
- Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
- The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
to:
2. Specimen preparation: Nissl
- This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
- The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
- The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
- After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
- The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
- After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
