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Summary
脳標本の準備からデータの可視化と分析に、ナイフエッジの走査型顕微鏡を使用してシリアルのセクショニング画像への完全なプロセスが記載されている。この手法は、現在のマウスの脳のデータを取得するために使用されますが、それは他の臓器、他の種に適用可能です。
Abstract
高スループット、高解像度、3D顕微鏡技術の大きな進歩は、サブミクロンの分解能で神経解剖学的、大量のデータの取得を有効にしている。全脳規模なデータを生成する最初のそのような楽器の一つは、ナイフエッジの走査型顕微鏡（KESM）7、5、9、開発し、著者らの研究室でホストされている。 KESMは、複雑な神経回路網の詳細（ゴルジ体）1、4、8、血管のネットワーク（墨汁）1、4、および細胞体の分布（ニッスル）3明らかに、セクションとサブミクロンの解像度で画像全体をマウスの脳に使用されています。 KESMの使用は、マウスでも脳に限定されるものではありません。私たちは正常にタコの脳6、マウスの肺、及びラットの脳を画像化している。我々は現在、全体のゼブラフィッシュの胚に取り組んでいます。微小循環および血行動態の研究に;これらのようなデータは大幅にconnectomics研究10に貢献できるとproviによる立体学の研究に鼎正確な地上真実。
この記事では、我々は試料作製（固定、染色、および埋め込み）を含むパイプライン、、KESMの設定とセットアップ、切片およびイメージングKESMと、画像処理、データの準備、およびデータの視覚化と分析を説明します。強調は、試料作製し、得られたKESMデータの可視化/分析になります。我々は、この記事で紹介する詳細なプロトコルがKESMとその利用率を高めるために、アクセスを広げるために期待しています。
Protocol
1。試料の準備：ゴルジ - コックス
- このプロトコルは、密接にMayerichらのプロトコルに従います。7。
- C57BL/6Jマウスは、イソフルラン吸入麻酔を使用して、深く麻酔し、断頭。
- 脳は、ゴルジ - コックスの固定液（1％クロム酸カリウム、1％重クロム酸カリウム、及び脱イオン水の1％塩化第二水銀）に削除され、配置されます。
- 脳は10〜16週間、室温で、暗所でゴルジ - コックスのソリューションに残されている。
- 脳は、暗所で一晩脱イオン水で洗浄されています。
- リンスの脳は、室温で暗所で7〜10日間脱イオン水で5％水酸化アンモニウム溶液中に浸漬される。この長い準備時間は、黒い沈殿物が完全に組織に形成するチャンスがあったように、脳全体の浸透性を確保することでした。
- 脳は4時間とt室温で脱イオン水で再び洗浄する室温で50％、70％、冷蔵庫（4℃）で、85％、95％（3の変更）、および100％（4〜5変更）：段階的なエチルアルコール、一連の脱水鶏。脳は、24時間ごとに溶液中に残っている。
- 脱水の脳は、1:2のアラルダイトからアセトンの比率、1:1、2:1、そして最終的ににあるアラルダイト - アセトン混合物、続いて（3〜4の変化、一日ごとに）アセトンに入れられ冷蔵庫に100％アラルダイト（3の変更、一晩たびに）、（4℃）。
- 最後に、処理された脳は、100％アラルダイトに包埋し、℃で3日間（アボットとソテロ2で参照されたい埋め込 みプロトコル）を60に加熱される。
標本はLRホワイトに埋め込まれている場合、検体は重合前に標準的な手順である各一晩冷蔵庫に保管されているLRホワイトソリューションの3つの変化を通じて、最後の100％エタノール溶液から転送されます。 3つの変更が完全に浸透を確保するために行われている。試料はtです。60密閉容器で重合される新鮮なLRホワイトに転送鶏°適切な重合のための時間と温度の必要量である24時間C、。 - 図。 1は、アラルダイトに埋め込まれているゴルジ - コックス染色した脳を示しています。
- 硬化試料ブロックは、エポキシ樹脂を用いて金属試料のリングに搭載されており、ブロックの側面は、（図2参照）、必要に応じてトリミングされます。
2。試料の準備：ニッスル
- マウスは、ケタミンとキシラジン（1.7mgをケタミン/ 20グラムの体重当たり0.26ミリグラムのキシラジン）腹腔内投与を使用して、深く麻酔ですし、transcardially部屋の250mLのに続いて、室温の液（pH7.4）リン酸緩衝生理食塩水50mLを用いて灌流中立温度10％液（pH7.4）緩衝ホルマリン。そして最終的に希釈していないインドのインク3.0 CCと。
- 生理食塩水と固定液で全身の血流は、心臓血管系から血液をクリアするとtiを修正する必要がある ssues。墨汁灌流は完全に心臓血管系の血管系を埋めるために必要です。
- その結果、脳は、傾斜エチルアルコール（25％-100％）の一連の後、脱水して、上記1.8から1.9のプロトコールに従って、アラルダイトプラスチックに埋め込まれています。 LR白埋め込むメディアの場合、上記の1.10プロトコルが続いている。
4。試料の調製：一般種、一般的な臓器
- 一般的なケースの場合、固定のいずれか10％中性緩衝ホルマリンあるいは4％パラホルムアルデヒドで行うことができます。
- 小さな組織のボリュームの場合、代わりに血流の拡散は固定と染色をお勧めします。小さな生物や臓器の場合には、また、染色は、脱水工程中に行うことができます。
- ソリューションの浸透のための時間が全体のマウスの脳よりもはるかに小さい臓器または生物のために削減できるものの、埋め込みプロトコルでは、上記と同じです。
- 舞台をオンに、ポンプの電源を切り、カメラをオンにする、照明をオンにします。
- ナイフと客観を上げる。
- 試料のリングを取り付けます。
- 測定試料の寸法とKESMステージコントローラ2アプリケーションの構成ファイルを作成します。
- KESMステージコントローラ2を起動し、ステージを初期化する。
- 下のナイフ/客観、ポンプの電源を入れます。
- 光学電車の中で焦点調節ノブを回すと、ナイフエッジに相対カメラの視野を調整することによって、客観的とカメラのピントを合わせる。
- イメージングを開始するには[戻る]を押してください。
- 図を参照してください。 3-8。技術的な詳細については、9、7を参照してください。
6。画像の処理とデータの準備
- 設定ファイルのフォルダ（00000、00001、等）の下でデータのフォルダにKESMスタックプロセッサの実行ファイルをコピーします。
- 照明のアーティファクトを削除し、すべてのバックグラウンド強度を正規化するKESMスタックプロセッサを実行するイメージ。すべてのデータのサブフォルダに対して手順を繰り返します。
- KESMの脳アトラスのWebサーバに設定し、アップロードとファイルの設定データからマルチスケールのタイルを準備します。
- 図を参照してください。 9。
7。データの可視化と解析
- KESMブレインアトラスを用いて可視化。に移動しhttp://kesm.cs.tamu.eduと適切なアトラスを選択してください。
- Googleマップのようにナビゲートします。
- Googleマップのように拡大および縮小。
- [ - ] zの深さを増加または減少させる別の深さに移動するには、どちらかの[+]またはをクリックし、プルダウンメニューから、各ステップでどのように深く関わって選択し、。
- プルダウンメニューを使用してオーバーレイの数を調整します。
- プルダウンメニューを使用してオーバーレイの間隔を調整します。
- 図を参照してください。 11。
- MeVisLabを使用して可視化。
- MeVisLabを起動します。
- 新しいプロジェクトを作成します。
- 以下では、新しいモジュールはTYによって作成することができますコマンドボックスにモジュール名でping。
- モジュールを作成する[Compose3Dfrom2DFiles]、および目的のフォルダへ移動。ファイルの文字列を入力し、[GetFileList]をクリックします。選択した画像がメモリに収まることを確認してください。 [Create3D]ボリュームを作成する]をクリックします。
- モジュール[SetWorldMatrix]、および"スケール"を設定の作成の下に適切なボクセルのサイズ（0.6、0.7、10X 0.45NA目標は1.0）にX、Y、Zを"小学校の変換"。リンク[Compose3Dfrom2DFiles]へ[SetWorldMatrix]。
- マトリックスを設定し、"進む"、"無視"、"無視"に"マトリックス組成"の下に変換します。
- モジュール[Arithmetic1]を作成し、"（マックス- IMG）反転"に"関数"を設定。
リンク[SetWorldMatrix]へ[Arithmetic1]。 - モジュールを作成する[View3D]と[Arithmetic1]を接続します。
- View3Dでは、マウスの右ボタンを押している間、しきい値を調整するためにマウスを動かす。あなたは、地域、変化の方向（マウスの左ボタンを押している間、マウスを動かす）、変更照明（ボリュームrenderinを切り抜くことができますなど、背景をgまたはMIP）をオン/オフ
- 図を参照してください。 10。
8。代表的な結果：
ここで、我々は、全脳データと詳細を提示する。イチジク。 12月15日ショー全脳インドインク、ゴルジ体、およびニッスルデータは1、4、3を設定します。
図1、固定染色し、そして埋め込 まれたマウスの脳
図2組み込み、マウスの脳標本は、標本のリングに取り付け。
図3。ナイフエッジスキャン顕微鏡（KESM）。 KESMの写真は、その主要なコンポーネントがマークで示されています：（1）高速ラインスキャンカメラ、（2）顕微鏡対物、（3）ダイヤモンドナイフのアセンブリと光のコリメータを、（4）SPEcimenタンク（水浸イメージングのための）、（5）三軸の精度エアベアリングステージ、（6）白色光顕微鏡の照明、組織切片の除去のための（7）水ポンプ（バックで）、（8）ステージ制御と画像取得のためのPCサーバ、（9）花崗岩のベース、および（10）花崗岩の橋。
図4。KESMのイメージングの原理。 KESMの操作のプリンシパルが示されている。目標とナイフは（広い5ミリメートル試料は20nmと1-5の移動速度の分解能での位置決めステージの移動（実線矢印）に貼付しながら、所定位置に保持される、とダイヤモンドナイフに対してこすりれる10Xの目的のために）、ナイフ（実線矢印）上を流れる薄セクションを生成する。ラインスキャン画像は、ナイフの非常に先端付近で行われます。
図5。KESMカメラと客観的な焦点をコントロール。
図6。KESMナイフのアセンブリとコントロール。
図7。初期観測ポートを介して焦点。
図8。KESMステージコン トローラ2アプリケーション（スクリーンショット）。
図9。KESMスタックプロセッサのアプリケーション（スクリーンショット）。
図10。MeVisLabアプリケーション（スクリーンショット）。
図11 KESM脳アトラス：Webベースインターフェース（スクリーンショット）。
図12。KESM全脳水墨データ。 KESMのデータスタックの体積の可視化は、血管のデータセットとして使用されています。 （a）のクローズアップ、血管データの。幅〜100ミクロン。 （BD）全体のマウスの脳の血管系の3つの標準ビュー（高解像度のデータから間引き）。幅〜10mmの。
図13。KESM全脳マウスゴルジデータ。
図14。KESMゴルジデータの詳細。
図15。KESM全脳ニッスルデータ。 （A）クローズアップNのISSLデータ。 〜300 UM 3。全マウスの脳ニッスルのデータ（高解像度のデータからサブサンプリング）の（BD）3つの標準ビュー。断面には、内部構造の明確な見解のために示され。
Discussion
KESMは、生物学的試料の大量のサブミクロンレベルの調査（〜1 cm 3）とすることができます。ボリュームのこの種は、これらの器官の構造的な組織についての前例のない量的な情報を提供し、様々な機能の計算機モデルを有効にすることができますこのような脳、肺、心臓、腎臓、などの全体の小動物の器官は、そのような器官から画像をスキャン保持するのに十分です。回路とネットワークダイナミクス、電気的性質、流体と空気の流れのダイナミクス、および筋肉のダイナミクスを含めてこれらの器官の側面、。
この記事で説明する試料調製のプロトコルとポスト解析のプロトコルがKESMへ簡単にアクセスし、結果のデータを持っている外部の研究グループを支援することが期待されています。 KESM操作プロトコルは、これらの外部の研究者がこのユニークな画像診断法の利点と限界を理解するのに役立ちます。
Disclosures
トッドハフマンは3Scan、KESM技術（米国特許＃6744572）を製造販売する営利企業となります。
Acknowledgments
このプロジェクトは、NIH / NINDS（＃1R01 - NS54252）、NSF（＃0905041、＃0079874）、テキサス先端技術プログラム（＃ATP - 000512〜0146 - 2001＃ATP - 000512〜0261 - 2001）、テキサス州で賄われていた＆M研究財団、テキサスA＆M大学のコンピュータ科学と工学科、および3Scan。我々は、技術相談やKESMインストルメンテーションのサポートのためのバーナードメサ（マイクロスターテクノロジーズ）に感謝いたします。 KESMの設計と実装の主要部分は2007年に亡くなったブルースH.マコーミック、によって行われた。
References
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- Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).
Tags
生体工学、問題58、物理的なセクショニング、シリアルセクショニング、光学顕微鏡、脳イメージング、ミクロトームErratum
Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 04/07/2013.
Citeable Link.
A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. The Nissl staining protocol was modified from:
2. Specimen preparation: Nissl
- The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
- Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
- The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
- The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
- Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
- The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
- The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
- Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
- The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
to:
2. Specimen preparation: Nissl
- This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
- The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
- The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
- After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
- The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
- After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
