Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Provberedning, Imaging och analysprotokoll för knivsegg Scanning Mikroskopi

Published: December 9, 2011 doi: 10.3791/3248
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 5
1Department of Computer Science and Engineering, Texas A&M University, 2Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Kettering University, 43Scan, 5Department of Veterinary Integrative Biosciences, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Hela processen från hjärnan extraktion till seriell sektionering avbildning med knivsegg scanningmikroskop, till data visualisering och analys beskrivs. Denna teknik används idag för att få uppgifter mus hjärnan, men det är tillämplig på andra organ, andra arter.

Abstract

Stora framsteg i hög genomströmning, högupplösta, 3D-mikroskopi tekniker har möjliggjort förvärvet av stora mängder neuroanatomiska data vid submicrometer upplösning. En av de första sådana instrument som producerar hela hjärnan skala data är knivsegg scanningmikroskop (KESM) 7, 5, 9, utvecklas och värd i författarnas labbet. KESM har använts för att sektionen och bild hela hjärnor musen submicrometer upplösning, avslöjar intrikata detaljer om neurala nätverk (Golgi) 1, 4, 8, vaskulär nätverk (tusch) 1, 4, och cellkroppen distribution (Nissl) 3 . Användning av KESM är inte begränsad till musen eller hjärnan. Vi har framgångsrikt avbildat bläckfisken hjärnan 6, mus lunga och råtta hjärna. Vi arbetar för närvarande med hela zebrafisk embryon. Uppgifter som dessa kan bidra mycket till connectomics forskning 10, att mikrocirkulationen och hemodynamisk forskningen och att stereology forskning genom bestämmelserding en exakt marken sanning.

I denna artikel kommer vi att beskriva utveckling, däribland extraktion (fastställande, färgning och inbäddning), KESM konfiguration och installation, sektionering och bildhantering med KESM, bildbehandling, data förberedelser, och data visualisering och analys. Tyngdpunkten kommer att ligga på extraktion och visualisering / analys av erhållna KESM data. Vi räknar med att detaljerat protokoll som presenteras i denna artikel för att bidra till att bredda tillgången till KESM och öka dess användning.

Protocol

1. Provberedning: Golgi-Cox

  1. Detta protokoll följer nära protokollet av Mayerich et al. 7.
  2. Den C57BL/6J musen är djupt sövda med isofluran inhalant anestesi och sedan halshuggna.
  3. Hjärnan tas bort och placeras i en Golgi-Cox fixering lösning (1% kaliumkromat, 1% kaliumdikromat och 1% kvicksilverklorid i avjoniserat vatten).
  4. Hjärnan är kvar i Golgi-Cox-lösning i mörker, i rumstemperatur, för 10 till 16 veckor.
  5. Hjärnan sköljs i avjoniserat vatten över natten i mörkret.
  6. Den sköljde hjärnan är nedsänkt i 5% ammoniumhydroxidlösning i avjoniserat vatten i 7 till 10 dagar i mörker vid rumstemperatur. Denna långa förberedelsetid var att se till infiltration av hela hjärnan, så att den svarta fällningen hade en chans att helt bildas i vävnaden.
  7. Hjärnan är sköljas på nytt i avjoniserat vatten i rumstemperatur i 4 timmar och thöna uttorkad genom en graderad serie etanol alkoholer: 50% och 70% i kylskåp (4 ° C) och 85%, 95% (3 ändringar) och 100% (4 till 5 förändringar) i rumstemperatur. Hjärnan är kvar i varje lösning i 24 timmar.
  8. Den uttorkade hjärna är sedan lägga i aceton (3 till 4 förändringar, var för en dag), följt av en Araldite-acetonblandning med Araldite till aceton förhållandet 1:2, 1:1, 2:1, och slutligen i 100% Araldite (3 ändras varje gång över natten), i kylskåp (4 ° C).
  9. Slutligen behandlas hjärnan inbäddad i 100% Araldite och uppvärmd till 60 ° C i 3 dagar (jfr inbäddning protokollet i Abbott och Sotelo 2).
    Om proverna är inbäddade i LR Vit sedan exemplar överförs från de senaste 100% etanol lösning genom tre förändringar av LR Vita lösning som är var förvaras i kylskåp över natten, vilket är ett standardförfarande före polymerisation. Tre förändringar görs för att säkerställa fullständig infiltration. Provet är thöna överföras till nya LR Vit som polymeriseras i en sluten behållare vid 60 ° C i 24 timmar, vilket är den krävs tid och temperatur för korrekt polymerisation.
  10. Fig. 1 visar en Golgi-Cox betsad hjärnan inbäddad i Araldite.
  11. Den härdade provet blocket är sedan monteras på metall provet ringen med hjälp av epoxi, och sidorna av blocket trimmade vid behov (se bild. 2).

2. Provberedning: Nissl

  1. Musen är djupt nedsövd med hjälp av ketamin och xylazin (1,7 mg ketamin / 0,26 mg xylazin per 20 gram kroppsvikt) injiceras intraperitonealt och sedan perfusion transcardially med 50 ml rumstemperatur fosfatbuffrad koksaltlösning (pH 7,4), följt av 250 ml rummet Temperaturen 10% neutral buffrad formalin (pH 7,4). och slutligen med 3,0 cc outspätt tusch.
  2. Hela kroppen perfusion med saltlösning och fixativ är nödvändigt att rensa blodet från det kardiovaskulära systemet och att fastställa TI RÅGOR. Perfusion med Indien bläck är nödvändigt för att helt fylla kärlsystemet av hjärt-kärlsystemet.
  3. Den resulterande Hjärnan är sedan uttorkade genom en serie graderade etyl alkoholer (25% -100%) och sedan inbäddade i Araldite plast efter protokollet i 1,8-1,9 ovan. Om LR vita är inbäddning mediet då protokollet i 1.10 ovan följs.

4. Provberedning: Generic arter, generiska organ

  1. För generiska fallet kan fixering ske med antingen 10% buffrat neutrala formalin eller 4% paraformaldehyd.
  2. För små vävnad volymer, är diffusion i stället för perfusion rekommenderas för fixering och färgning. I fråga om små organismer eller organ kan färgning också göras under uttorkning processen.
  3. Den bädda protokollet är samma som ovan, även om tiderna för lösningen infiltration kan reduceras till organ eller organismer som är mycket mindre än hela musen hjärnan.
jove_title "> 5. KESM installation och bildhantering

  1. Stäng av pumpen, sätter på scenen, sätter på kameran, slå på belysningen.
  2. Höj kniv och mål.
  3. Installera exemplar ringen.
  4. Mät prov dimension och skapar en konfigurationsfil för KESM scenen Controller2 ansökan.
  5. Starta KESM Stage Controller2 och initiera skede.
  6. Lägre kniv / mål, slå på pumpen.
  7. Fokus objektiv och kamera, genom att vrida fokus ratten på den optiska tåget och justera kamerans synfält i förhållande till knivseggen.
  8. Tryck på [GO] för att påbörja avbildning.
  9. Se fikon. 3-8. Se 9, 7 för tekniska detaljer.

6. Bildbehandling och data beredning

  1. Kopiera KESM körbara Stack processorn i Data-mappen i konfigurationsfilen mappen (00000, 00001, osv.)
  2. Kör Processor KESM Stack att ta bort belysning artefakt och normalisera bakgrunden intensiteten i allabilder. Upprepa för alla uppgifter undermappar.
  3. Förbered Flerskalig brickor från uppsättning uppgifter och ladda upp och skapa filer i KESM Brain Atlas webbserver.
  4. Se figur. 9.

7. Data visualisering och analys

  1. Visualisering med hjälp av Atlas KESM Brain. Gå till http://kesm.cs.tamu.edu och välj lämplig Atlas.
    1. Navigera som i Google Maps.
    2. Zooma in och ut som i Google Maps.
    3. För att gå till ett annat djup, välja hur djupt att gå vid varje steg från rullgardinsmenyn och klicka på antingen [+] eller [-] för att öka eller minska z djup.
    4. Justera överlägget numret med rullgardinsmenyn.
    5. Justera överlägget intervallet genom att använda rullgardinsmenyn.
    6. Se figur. 11.
  2. Visualisering med hjälp MeVisLab.
    1. Starta MeVisLab.
    2. Skapa ett nytt projekt.
    3. I det följande kan nya moduler kan skapa genom att typing i modulen namn i kommandofönstret.
    4. Skapa modul [Compose3Dfrom2DFiles], och gå till önskad mapp. Ange fil sträng och klicka på [GetFileList]. Se valda bilder får plats i minnet. Klicka på [Create3D] för att skapa volym.
    5. Skapa modul [SetWorldMatrix] och ställ in "Skala" under "Elementary transformer" x, y, z till lämplig Voxel storlek (0,6, 0,7, 1,0 för en 10X 0.45NA mål). Länk [Compose3Dfrom2DFiles] till [SetWorldMatrix].
    6. Ställ Matrix och transformer under "Matrix sammansättning" för att "Ignorera", "Ignorera", "Framåt".
    7. Skapa modul [Arithmetic1] och ställ in "funktion" för att "Invertera (Max-img)".
      Länk [SetWorldMatrix] till [Arithmetic1].
    8. Skapa modul [View3D] och anslut [Arithmetic1].
    9. I View3D, medan höger musknapp är nedtryckt, flytta musen runt för att justera tröskeln. Du kan beskära regioner, ändra riktning (flytta musen medan vänster musknapp trycks ned), ändra belysning (volym rendering eller MIP), slå på / av bakgrund, etc.
    10. Se figur. 10.

8. Representativa resultat:

Här presenterar vi hela hjärnan data och detaljer. Fikon. 12-15 visar hela hjärnan tusch, Golgi och Nissl datamängder 1, 4, 3.

Figur 1
Figur 1. Fast, färgade och inbyggda mus hjärnan

Figur 2
Figur 2. Embedded musen hjärnan provet monteras på provet ringen.

Figur 3
Figur 3. The Knife Edge scanningmikroskop (KESM). Ett foto av KESM visas med dess stora delar markerade: (1) höghastighetslinjen-scan kamera, (2) mikroskop mål, (3) diamant kniv montering och ljus kollimator, (4) SPEcimen tanken (för nedsänkning i vatten imaging), (5) tre-axliga Precision Air räntebärande stadium, (6) vitt ljus mikroskop belysning, (7) vattenpump (i ryggen) för avlägsnande av sektioneras vävnad (8) PC-server för scen kontroll och bild förvärv, (9) granit bas, och (10) granit bro.

Figur 4
Figur 4. Imaging principer KESM. Den främsta verksamhetsår KESM illustreras. Målet och kniven hålls på plats, medan provet anbringas på rör positionering scenen (pil med heldragen linje) med samma upplösning som 20 nm och körhastighet på 1-5, och får skrapade mot diamant kniven (5 mm bred för 10X mål), vilket ger ett tunt avsnitt strömmar över kniven (pil med heldragen linje). Line-scan avbildning sker nära den yttersta spetsen av kniven.

Figur 5
Figur 5. KESM kamera och objektiv fokuserar kontroller.

Figur 6
Figur 6. KESM kniv montering och kontroll.

Figur 7
Figur 7. Inledande fokus genom observation porten.

Figur 8
Figur 8. KESM etapp Controller 2 ansökan (skärmdump).

Figur 9
Figur 9. KESM stack processor ansökan (skärmdump).

Figur 10
Figur 10. MeVisLab ansökan (skärmdump).

Figur 11
Figur 11 KESM Brain Atlas:. Webb-gränssnittet (skärmdump).

Figur 12
Figur 12. KESM hela hjärnan tusch data. Volym visualiseringar av KESM uppgifter stackar visas för vaskulära datamängden. (A) Närbild av vaskulära data. Bredd ~ 100 um. (BD) Tre standard utsikt över hela musen hjärnan kärlsystemet (subsampled från högupplösta data). Bredd ~ 10mm.

Figur 13
Figur 13. KESM hela hjärnan mus Golgi data.

Figur 14
Figur 14. KESM Golgi uppgifter detaljer.

Figur 15
Figur 15. KESM hela hjärnan Nissl data. (A) Närbild av Nissl data. ~ 300 um 3. (BD) Tre standard utsikt över hela Nissl musen hjärnan data (subsampled från högupplösta data). Tvärsnitt visas för en tydlig bild av den interna strukturer.

Discussion

Den KESM möjliggör en submicrometer nivå kartläggning av stora volymer av biologiska prov (~ 1 cm 3). Denna typ av volymen är nog att rymma hela litet djur organ, såsom hjärna, lungor, hjärta, njurar, Skannade etc. bilder från ett sådant organ kan ge oöverträffad kvantitativ information om den strukturella organisationen av dessa organ, och aktivera datormodellering av olika funktionella aspekter av dessa organ, inklusive kretsar och nätverk dynamik, elektriska egenskaper, vätska och luft dynamik flöde och muskulös dynamik.

Den extraktion protokoll och efter analys av protokoll närmare i denna artikel förväntas hjälp utanför forskargrupper att få enklare tillgång till KESM och resulterande data. Den KESM drift-protokollet kommer att hjälpa dessa externa forskare att uppskatta fördelarna och begränsningarna med denna unika avbildning modalitet.

Disclosures

Todd Huffman är med 3Scan, ett kommersiellt företag som tillverkar och marknadsför KESM Technology (US Patent # 6.744.572).

Acknowledgments

Detta projekt har finansierats av NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0.905.041, # 0.079.874), Texas Advanced Technology Program (# ATP-000.512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A & M Research Foundation, Institutionen för Datavetenskap vid Texas A & M University, och 3Scan. Vi vill tacka Bernard Mesa (Micro Star Technologies) för teknisk konsultation och stöd för KESM instrumentering. Stora delar av utformningen och genomförandet av KESM gjordes av Bruce H. McCormick, som dog 2007.

References

  1. Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).
  2. Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
  3. Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).
  4. Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).
  5. Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).
  6. Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
  7. Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
  8. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
  9. McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).
  10. Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).

Tags

Bioteknik Fysisk sektionering seriell sektionering ljusmikroskopi hjärnröntgen mikrotom

Erratum

Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 04/07/2013. Citeable Link.

A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. The Nissl staining protocol was modified from:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  2. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  3. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  4. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  5. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  6. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  7. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  8. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  9. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.

to:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
  2. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
  3. The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
  4. After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
  5. The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
  6. After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
Provberedning, Imaging och analysprotokoll för knivsegg Scanning Mikroskopi
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J.,… More

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., Huffman, T., Keyser, J., Abbott, L. C. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter