فيديو معدل الميكروسكوب متحد البؤر المسح الضوئي وMicroendoscopy

Summary

يوصف البناء كاملة مخصصة ، في الوقت الحقيقي المسح مبائر نظام التصوير. هذا النظام ، والتي يمكن استخدامها بسهولة لمعدل الفيديو وmicroendoscopy المجهري ، ويسمح لمجموعة من التطبيقات وهندستها التصوير لا يمكن الوصول إليها باستخدام معيار نظم مبائر التجارية ، في جزء صغير من التكلفة.

Abstract

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets¹, monitor dynamics in living cells^2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms^5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo⁷ and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings^8,9.

Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called “optical sections” using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.

Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole¹, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.

Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.

In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

Protocol

وينبغي أن تحدد اختيار الطول الموجي الليزر ، مرآة مزدوج اللون ، والمرشحات الضوئية القائمة على الأصباغ محددة المستخدمة في التجربة. على سبيل المثال ، هو أفضل إنجاز التصوير مبائر عينة ملطخة فلور اليكسا 488 باستخدام ليزر 488 نانومتر ، وطوله 500 نانومتر مرور مرآة مزدوج اللون ، وعرض النطاق الترددي 30 نانومتر مرآة تركزت في ممر الموجة 515 نانومتر. في المقابل ، سيكون التصوير مبائر من فلور صبغ أحمر اليكسا 647 تتطلب مجموعة مختلفة من المكونات. بنيت المجهر في هذا البروتوكول لتصور أي صبغة التي تمتص بقوة في 400 نانومتر ، وتنبعث تتجاوز 450 نانومتر. اخترنا بالتالي إثارة 406 نانومتر ليزر و425 نانومتر طويلة تمرير مزدوج اللون لتعكس أشعة الليزر. يمكن أن يتصور fluorophores متحمس بشكل انتقائي من خلال تحديد المرشحات الانبعاثات المناسبة. من المهم أن الاستخدام السليم للأجهزة البصرية متزايدة في جميع أنحاء حيث أشار بروتوكول ؛ الأجهزة غير لائق أو مؤقتة لن يعقد محاذاة كذلك ، ويمكن أن يشكل خطرا على السلامة. <ع = فئة "jove_title"> 1. وضع المرآة galvanometric الرنانة والبصريات التتابع مفهوم هام في بناء أي نوع من نظام المسح هو مبائر telecentricity. في النظام البصري telecentric ، متباعدة عن بعضها البعض العدسات على مجموع أطوالها التنسيق ، بحيث يتم تعريف ببساطة التكبير للنظام نسبة أطوال التنسيق 1. وهذا يمكن بناء نظام التتابع البصري حيث يتم تعريف بسهولة تكبير ، وبالتالي خصائص النظام ، عن طريق اختيار العدسات. مفهوم آخر مهم ينطوي على "ثابتة" ما يسمى طائرات البصرية ، ويشار إليها أيضا باسم "الطائرات الفتحة". طائرة الفتحة هو موقف على طول المسار البصري حيث شعاع الضوء لا تخضع لأي نوع من الحركة الجانبية. في هذا التصميم المجهر ، وهناك ثلاث طائرات الفتحة مهمين : الأول والثاني يعكس المسح ، والخلفية فتحة العدسة الهدف. من أجل تحقيق أقصى قدر من الحزم هيئة السلع التموينيةnning على المستوى البؤري لهذا الهدف ، يجب أن شعاع دخول الفتحة الخلفية للعدسة يكون الهدف ثابتة ، إلا في زاوية واسعة. من أجل إنشاء هذا ثابت ، الزاوية اجتاحت الطائرة ، ونحن بحاجة لوضع المرايا الأول والثاني في المسح المتقارن والطائرات telecentric بهدف العودة الفتحة. العدسات وضعت بين المرايا والعدسات لخدمة الهدف تتابع شعاع الزاوية الممسوحة بين هذه الطائرات ثابتة (الشكل رقم 2). هي التي شنت المرايا المسح على اثنين galvos المسح ، كل منها مسؤولة عن المسح اتجاه معين من الطائرة التصوير (X و Y). للحصول على خط المسح المطلوبة لمعدل سعر الفيديو والتصوير ، ومطلوب galvo عالية التردد مدوية لمسح محور س (المعروف أيضا باسم محور "سريع"). هذه galvos الاستفادة من حساسية ، ردود فعل الدوائر حلقة مغلقة لخلق نمط مسح جيبية وتكون قادرة على العمل في الترددات العالية جدا ، ونحن اختيار أحد galvo 8 كيلو هرتز لهذا البناء. إعدادوميزاء الألياف البصرية في الجبل وتوجيه شعاع تقريبا باستخدام مسامير التكيف بحيث تنتقل في خط مستقيم أفقيا ورأسيا. الآن ، تأخذ قزحية ووضعه أمام ميزاء الألياف ، وتعديل ارتفاع قزحية الرأسي بحيث يمر شعاع نظيفة من خلال مركز القزحية. المقبل ، نقل قزحية بعيدا عن ميزاء على طول مسار الشعاع ومراقبة إذا كان لا يزال شعاع يسافر من خلال مركز القزحية. إن لم يكن ، وضبط الموقف شعاع على قزحية باستخدام مسامير التكيف اثنين. مكان المرآة التي شنت في مسار مزدوج اللون شعاع شعاع الليزر مع وضعه في المركز ما يقرب من المرآة. قبل لقط المرآة الى طاولة المفاوضات ، وتناوب صاحب مرآة تعكس الشعاع في حوالي 90 درجة وضبط ما يقرب من انعكاس ارتفاع بحيث ينعكس شعاع الليزر في رأسي لا يتغير. وضع المرآة التي شنت galvanometric الرنانة في مسار شعاع الليزر ، مع سيارةه لضمان أن يتم وضع شعاع الليزر في المركز الأفقي الدقيق لسطح المرآة. في هذا البروتوكول ، وكان expoxied المرآة galvo الرنانة مباشرة إلى جبل المرآة. تدوير جبل مرآة تعكس شعاع الليزر بزاوية 90 درجة. ضبط ما يقرب من انعكاس قبالة مرآة للحفاظ على شعاع الليزر الارتفاع العمودي نفسه. من أجل توجيه أي شعاع من الضوء في اتجاه معين ، لا بد من تحديد تعريف بواسطة نقطتين في الفضاء من خلال الأشعة التي سوف السفر. عادة يتم إنجاز هذا عن طريق قزحية العين وضعت اثنين على طول المسار المطلوب الأفقي والرأسي والتلاعب شعاع الليزر بالمرور عبر مركز كل القزحية. مطلوبة أربع درجات من الحرية لضبط شعاع ؛ درجتين الأفقي والرأسي للحرية لكل القزحية. الطريقة الأكثر شيوعا واضحة لتحقيق هذه درجات الحرية هو استخدام اثنين من المرايا لتوجيه ، أو "السير" ، وهو شعاع الليزر. القزحيات يستغرق عامين ، وتعيين ارتفاعها العموديفي الخطوة 1.1 ، وذلك باستخدام شعاع الليزر المنعكس من المرآة galvo الرنانة كمرجع. الآن ، وذلك باستخدام فتحات المسامير على اللوح الضوئية كدليل للعين ، المشبك والقزحيات two أسفل في خط مستقيم. ضبط مرآة مزدوج اللون ومرآة galvo مدوية لتوجيه شعاع الليزر من خلال مركز القزحيات اثنين. استخدام المرآة الأولى في المسار (المرآة مزدوج اللون) إلى مركز الشعاع على القزحية الأولى ، ثم استخدام المرآة الثانية في المسار (المرآة galvo الرنانة) لشعاع المركز على قزحية العين الثانية. ضبط تكرارا هذه المرايا اثنين حتى يتم محاذاة شعاع سواء عن طريق قزحية العين ، وضمان أن ينعكس في جميع أنحاء يزال شعاع الليزر المنعكس من المرآة galvo مدوية من مركز المرآة تقريبية. إذا انحرف شعاع ، وضبط جبل ميزاء الألياف وكرر الخطوات التكرارية أعلاه. مع شعاع تركز على كل من القزحيات ، فإننا سوف نضع الآن تتابع العدسات اثنين من شأنها أن أول صورة ثابتة ، وخطة telecentricه (أي المرآة galvo الرنانة) على متن طائرة الثاني لنا والقرطاسية telecentric (أي معيار السرعة galvo مرآة). لهذا مجهر خاص ، العدسات المحدد في التتابع الأولى التي طول نفس تنسيق "، و" ، وبالتالي فإن المسافة بين اثنين من المرايا في النظام لدينا هو ببساطة telecentric 4F. للتأكد من أن تتركز على وجه التحديد العدسات في مسار الشعاع ، استخدم خدعة محاذاة العدسة. مكان العدسة الأولى في مسار الشعاع وننظر في شعاع الليزر بقعة على القزحية المقبل في مسار شعاع التالية العدسة. المقبل ، وضبط ارتفاع العدسة عموديا بحيث مركز العمودي للشعاع في مركز القزحية. أخيرا ، وضبط الوضع الأفقي لشعاع شعاع المركز على قزحية العين. تنفيذ هذا الإجراء نفسه بالنسبة للعدسة الثانية. 2. وضع المرآة المسح الثاني وتناوب المجهر للعثور على الموضع الدقيق للطائرة telecentric الثانية ، وعقف galvo الرنانة إلىفي وحدة المسح الضوئي وتشغيله. استخدام بطاقة بيضاء الأعمال لتعقب الشعاع المسح الضوئي من خلال عدسات اثنين. ستجد الطائرة telecentric على مسافة تقارب 4F من galvo الرنانة ، حيث شعاع الليزر سوف تظهر ثابتة تماما. بمناسبة هذا الموقف على اللوح. موقف القياسية مرآة galvo المسح في هذا الموقع telecentric الطائرة بالضبط ، وضبط ارتفاع المرآة ومثل هذا الموقف أن الشعاع على الطائرة telecentric يضرب وسط الدقيق للمرآة المسح. فمن الأهمية بمكان يصل الى السلطة السيطرة على الأجهزة المرآة ووضع جهد 0 فولت على مدخلات مرآة المسح بحيث يستقر مرآة لموقفها المحايد أثناء هذه العملية. ضبط زاوية المرآة بعناية لتوجيه شعاع عموديا ، وتشديد بلطف المرآة في الموقف. كما نقوم ببناء مجهر تستقيم ، وسوف نعلق الآن اللوح الثاني في زاوية 90 درجة 90 درجة استخدام الأقواس في تصاعد مستمر. تأكد من إيقافالليزر والالكترونيات المسح الضوئي ، وفصل الألياف ، وقطع المرايا المسح خلال هذه العملية. لجعل بقية أسهل المحاذاة ، مرة واحدة وانسحب الأقواس في مكانها ، وتناوب بعناية المجهر بأكمله بحيث اللوح الجديد هو الكذب الآن المسطحة. استخدام المشبك لإصلاح اللوح إلى سطح العمل. ويمكن الآن أن تكون الفترة المتبقية من الإعداد العمودي سابقا يسهل حملها خارج على اللوح المسطح. 3. إعداد المسح الضوئي ، أنبوب ، والعدسات الهدف القادم سوف نقوم بإعداد مجموعة ثانية من العدسات التتابع ، المشار رسميا باسم "عدسة المسح الضوئي" و "عدسة أنبوب". فمن المهم اختيار الحق في الجمع بين العدسات ، وذلك لتحقيق التكبير صحيحة في التركيز الموضوعي وتحسين دقة وضوح الصورة النهائية. أولا ، لتحقيق أقصى قدر من الفتحة العددية (NA) من أي عدسة هدف معين ، يجب أن شعاع الليزر ضرب الجزء الخلفي من الهدف ملءالفتحة الخلفية تماما ، وعندئذ فقط يكون الهدف عدسة قادرة على خلق التركيز أشد. العدسات الهدف لديها مجموعة من الأحجام فتحة الظهر اختارت نسبة التكبير العدسة لفعم قليلا الفتحة الخلفية للهدف المحدد. الثانية ، من أجل تحقيق التكبير الحق ، يجب أن تكون مطابقة للعدسة موضوعية مع أنبوب طول العدسة المحورية التي صممت من أجلها. للأسف ، اختارت مختلف الصانعين الهدف المجهر لاستخدام أطوال مختلفة في عدسة أنبوب الوصل ، لذلك فمن المهم لبناء مجهر مع عدسة أنبوب الصحيح للعدسة المستخدمة هدف محدد. وعلاوة على ذلك ، مصنعين معينة ، مثل زايس ، وتصميم العدسات أنبوب لتعويض لوني الانحرافات محددة هدفها المتطابقة ، مثل أن الزوج غير لائق باستخدام عدسة الهدف أنبوب سوف أعرض عن الانحرافات في الواقع الجديد الذي لن يكون إلا الحاضر. نحن نفضل عادة أهداف أوليمبوس ، كما يتم تنفيذ جميع التعويضات لوني في اله الهدف نفسه ، مما يجعل الهدف عدسة / أنبوب الاقتران أسهل. على الرغم من أن المجهر لا تزال تعمل ، وإذا كان الهدف عدسة أنبوب لا تتطابق ، فإن التكبير المجهر الفعلية من المحتمل أن لا تتطابق مع التكبير المدرجة في عدسة الهدف. بناء على هذا المجهر وجه الخصوص ، تم تحديد حجم الفتحة الخلفية الأمثل ليكون 4 ملم ، والتي تتطلب نسبة التكبير 01:04 بين عدسة المسح الضوئي وعدسة الأنبوب. لهذا المجهر مخصصة بناء وسوف نستخدم طول عدسة المسح الضوئي من 75 ملم وبطول أنبوب العدسة من 300 مم. وتبلغ المسافة الإجمالية بين المرآة المسح الثاني والهدف من ذلك هو تركيز كبير ، وهذا جزء من بناء وتخطيط المجهر لأول مرة المرايا اللازمة لتوجيه شعاع لعدسة الهدف. أول مكان كبير ، 2 "(50 ملم) مرآة قطرها على مقربة من حافة اللوح ، وتدوير جبل مرآة تعكس أشعة الليزر نحو 90 درجة. ضبط ما يقرب من انعكاس قبالة مرآة للحفاظ على نفس BEA العموديم الارتفاع. مكان الآخر 2 "على حافة المرآة المقابلة من اللوح في هذا التوجه الذي يوجه شعاع الهبوط بزاوية 90 درجة. استخدام مسامير التكيف لضمان ارتفاع شعاع الرأسي لا يتغير. إنشاء شركتين القزحيات ، كما في الخطوة 1.4 ، وضبط اثنين من المرايا وفقا لتوجيهات في الخطوة 1.5 إلى مركز الشعاع على قزحية العين. مع القزحيات تزال في مكانها ، ضع عدسة المسح الضوئي في مسار الشعاع وتعديل موقفها الأفقي والعمودي لمركز بقعة الليزر على القزحية الأولى. على مسافة 75 مم + 300 ملم من العدسة (بين اثنين من المرايا) ، ومكان بعناية كبيرة 2 عدسة أنبوب "وتعديل موقفها الأفقي والعمودي لمركز شعاع على القزحية الأولى. لأغراض الحفاظ على التوافق في المستقبل ، فمن المفيد أن ترك هذه القزحيات في المكان ؛ لهذا التطبيق ، يمكن لصقها على بطاقة تجارية مع حفرة بحجم مناسب لموقف وإدراجه في مسار الشعاع. مع كل المرايا والعدساتالآن في المكان ، يبدأ المسح المرآة galvo الرنانة والمرآة المسح القياسية. في هذا البناء ، وسوف في نهاية المطاف مرآة المسح القياسية يكون مزامن لفحص معدل المرآة مدوية من خلال دائرة التحكم مبنية خصيصا ، مثل تلك التي وصفها في الشكل (3) ، وهذا يوفر متفوقة التزامن الرأسي والأفقي. ومع ذلك ، لأغراض التوافق والعديد من تطبيقات التصوير ، يمكن بسهولة المرآة يتم فحصها باستخدام نمط مشرشف مثل سن المنشار من مولد وظيفة. باستخدام بطاقة الأعمال ، وتحديد موقع شعاع الليزر على بعد 300 ملم موقف العدسة الأنبوب. على الرغم من أن شعاع المسح في أماكن أخرى من المجهر في كل من الاتجاهين الرأسي والأفقي ، ينبغي أن تكون ثابتة تماما شعاع بالقرب من هذا الموقع. هذا هو المكان الذي سيتم وضع فتحة العدسة الخلفي من الهدف. إذا كانت طائرات عمودية وأفقية ثابتة لا تتوافق في نفس الطائرة على طول مسار الشعاع ، unclamp بعناية وترجمة العدسة على طول مسار أنبوب الضوئية لضمانكلتا الطائرتين التداخل بأكبر قدر ممكن. مركز اعادة الوضع الرأسي والأفقي للعدسة وأنبوب المشبك بشكل آمن في الموقف. وضع عدسة الهدف في مسار الشعاع ، مع التأكد من وضع العدسة الهدف الفتحة مرة أخرى أقرب إلى طائرة ثابتة قدر الإمكان. قد لا يعود في الواقع الهدف الحقيقي الفتحة يكون موجودا دائما في افتتاح العودة الفعلية للهدف بسبب تباين الخيارات تصميم الشركة المصنعة. ولذلك فمن الأفضل دائما أن تحقق مع الشركة المصنعة لتحديد الفتحة الخلفية الحقيقية الموقف. إعداد المرحلة العينة ، والتأكد من أن يشن الترجمة من شأنها أن تسمح للض محور الحركة يمكن ان تتحرك على مجموعتها الكاملة من دون الوقوع في جبل عدسة الهدف. 4. إعداد ومواءمة الثقب مبائر وكاشف قطع كل امدادات الكهرباء والألياف البصرية ، وتدوير التجميع المجهر بحيث تقع مرة أخرى على اللوح عقد قرار يتخذنانت مرآة المسح. المشبك على اللوح في مكان آمن ، ثم إعادة توصيل الألياف إلى ميزاء ، وإعادة الاتصال كلا galvos والكابلات لسيطرتها. كما كان من قبل ، ومكان 0 فولت على الجهد سيطرة قيادة galvo معيار المسح. على المسرح عينة ، ضع بطاقة عمل أو وحدة تخزين صغيرة من صبغة ساطعة في تركيز الهدف ، تقع بين اثنين من coverslips. سيتم اختيار الصبغة تعتمد على الليزر ومزدوج اللون المحدد ، وفي هذه الحالة سوف نستخدم انبعاث مضان من بطاقة بيضاء لرجال الأعمال محاذاة نظام الكشف مبائر. يمكن أن تكون نقاط الكم أيضا مفيدة لأغراض المواءمة ، لأنها لا مشرق وphotobleach. بدائل أخرى تشمل الخرز الفلورسنت و / أو عينات النسيج يتعرض للون / منير الغسيل ، وكلاهما يتألق الزاهية. بدوره على مصدر الليزر وإحضار العينة إلى التركيز باستخدام مجهر مرحلة الترجمة. مرة واحدة في التركيز ، ويجب أن مضان المتولدة من العينة أن تكون مرئية وراء رانه مرآة مزدوج اللون ، كما هو موضح في الخطوة التالية. تعظيم قوة الليزر لجعل مشرق مضان كما ممكن. باستخدام بطاقة الأعمال ، وتتبع الانبعاثات مضان من العينة من خلال عدسة موضوعية والعودة عن طريق نظام المسح الضوئي للمرآة مزدوج اللون. سوف المرآة مزدوج اللون يحيل الانبعاثات مضان بينما تعكس أشعة الليزر ؛ تجد هذه الإشارة مضان على الجانب الآخر من المرآة مزدوج اللون. الآن ، وضع مرآة وراء المرآة مزدوج اللون واستخدامه لتعكس الانبعاثات بزاوية 90 درجة. تأخذ قزحية ، كما حدث في الخطوة 1.1 ، واستخدامها جنبا إلى جنب مع مرآة لتوجيه شعاع مضان ومستقيمة وموازية للاللوح ممكن. قد تكون هذه الخطوة يتم على أفضل وجه في ضوء خافت. إنشاء وحدة ذات الثقب مبائر كما هو موضح في الشكل رقم 2. لقد وجدنا أن المكاني تصفية قفص جبل التجمع من ThorLabs مثالية لهذه المهمة. فمن المهم لاختيار المناسب pinholحجم البريد للتأكد من أن النظام مبائر يصل قرارها المثلى دون التضحية إشارة كثيرا. مخصصة لهذا المجهر ، تم اختيار حجم الثقب من 100 ميكرون. مكان وحدة مكانية التصفية وفقا لمسار شعاع مضان ، مع الحرص على مركز أول عدسة يشن التركيز على انبعاث شعاع مضان. بعد تركيب العدسات قصيرة البعد البؤري في وحدة (ويمكن أيضا أن تستخدم الهدف المجهر) ، جبل الشريحة Z الترجمة حتى يمكن ملاحظة وجود تركيز واضح على السطح ذات الثقب. تأكد من وحدة كلها موجهة على طول خط مستقيم الدقيقة التي وضعتها شعاع مضان. المشبك الوحدة إلى اللوح. انبعاثات من معظم عينات ضعيفة بالمقارنة مع مستويات الضوء المحيطة حتى في غرف مظلمة. فمن الأهمية بمكان أن كافية التدريع / ضوء المحير أن تستخدم على طول مسار الانبعاثات لحماية من التلوث ضوء شارد. وعلاوة على ذلك ، فإن ارتفاع مستويات الإضاءة المحيطة الزائد وتلف العديد من هذه الفرق ، ولا سيما مع عدم وجود جurrent الحماية. ولذلك فإن القراء وحثت بقوة على استخدام أنابيب العدسة لإحاطة المسار شعاع الانبعاثات ؛ نظام محمية بشكل صحيح ، مثل واحد تظاهر هنا ، هو قادر على العمل في ضوء الغرفة مع قليل من عدم وجود تلوث ضوء شارد. الآن ، وذلك باستخدام المقابض التكيف على المسرح الترجمة ، تحرك بشكل منهجي الثقب مبائر للعثور على النقطة التي يتم تكبير الإشارة مضان من خلال الثقب. هو الأكثر بسهولة تحديد هذا الموقف من خلال تكرارية تعديل المحورين لإجراء بحث 2D على سطح جبل ذات الثقب. مرة واحدة تم العثور على موقف إشارة تعظيم ، ضع العدسة الموازاة على جبل القفص بعد ذات الثقب. العثور على الانبعاثات مضان أن يذهب من خلال وحدة مبائر باستخدام بطاقة الأعمال ، والانزلاق على طول العدسة الموازاة الوظائف حتى يتم موازى كما إشارة مضان المنبعثة ممكن. بمجرد موازى للشعاع ، تأكد من وضع المرشح المناسب في مسار شعاع في حوض العدسةه. إنشاء أنبوب مضخم للضوء (PMT) التجمع. وضع عدسة 50 ملم طول بؤري في مسار انبعاث شعاع مضان والعثور على نقطة اتصال باستخدام بطاقة الأعمال. بمناسبة هذا الموقف على اللوح. الآن ، وإيقاف ليزر تماما — وهذا هو المهم ، كما طائشة أو unattenuated ضوء الليزر يمكن ان تضر بشكل دائم معظم هذه الفرق. موقف PMT بحيث تقع المنطقة النشطة وعلى مقربة من نقطة الاتصال ملحوظ ممكن. ربط التجمع PMT لعدسة التركيز باستخدام أنابيب عدسة قابل للتعديل ، والتفاف الشريط بعناية الداكنة حول كافة المسارات شعاع يتعرض عقب ذات الثقب. بدوره على الليزر ، ولكن تأكد للحفاظ على قوتها متدنية للغاية لدرجة أن الانبعاثات مضان بالكاد مرئيا. بدوره على PMT ، والقراءة بعناية فولطيتها على الذبذبات كما هو زيادة الجهد السيطرة. ويولد إشارة PMT من خلال سلسلة من المراحل الإلكترون ضرب ، وإذا كان photocurrent عالية جدا عن الحادث مستوى الضوء ، ويمكن أن أنبوبولذلك فإن هذه الفرق تضررت بشكل لا رجعة فيه. الدوائر الحالية مع الحد الموصى به للغاية ، خاصة بالنسبة للمستخدمين الذين لا يعملون مع أجهزة الكشف عن مثل هذه من قبل. زيادة الجهد السيطرة PMT حتى يمكن رؤية مثل ارتفاع قراءات و / أو تعويض العاصمة على الشاشة الذبذبات ؛ بالنسبة لمعظم هذه الفرق ، وهذا سيكون إشارة سلبية بالنسبة إلى الأرض. تأكد من أن هذه الإشارة تنشأ في الواقع من مضان من خلال تحويل قوة الليزر لمراقبة قبالة فقدان الإشارة. أخيرا ، في محاذاة الثقب تكرارا للإشارة الأقصى على الذبذبات من خلال التلاعب أول عدسة التركيز ض الموقف ، ومن ثم تعديل YZ مرحلة الترجمة. مجهر الأجهزة الفيديو معدل اكتمال! الخطاف الآن في المرايا ، لوحات التحكم المخصصة ، والكمبيوتر تخطيطي كما في الشكل 3. كما ذكر أعلاه ، فمن المستحسن استخدام نظام التصوير لتصور لأول مرة حجم القياسية المعروفة للعثور على القرار الأمثل للمجهر وحساب بكسلإلى قرار ثابت لنظام التصوير. هناك معايير كثيرة الحجم التي يمكن استخدامها ، مثل بطاقات الأعمال بيضاء مع أحجام الرسالة معروفة ، أو مضان تعكس أهداف القوة الجوية ، والمجهرية الفلورسنت. 5. إعداد نظام لمسح microendoscopy مبائر في هذا نستخدم بناء الألياف صورة متماسكة ، والذي يتألف من مجموعة من عدة آلاف من النوى الألياف ؛ مثل هذا الترتيب يسمح تنتقل الصورة من خلال الألياف وإعادة بنائها بسهولة و / أو توسيع في الطرف الآخر (الشكل 4). غير مصقول حزمة الألياف متماسكة المستخدمة في بناء هذا المنظار على طرفي ، مما يجعل من ما يسمى ب "الاتصال وضع" microendoscope. وبالتالي فإن صورة في التركيز فقط يتم تشكيلها عندما يتم جلب غيض microendoscope على اتصال وثيق مع كائن. في هذا الترتيب الزائف مبائر ، والعمل من المسح المجهر الليزر يركز على واحد وiber الأساسية في وقت واحد ، في حين أن الثقب مبائر يضمن أن لا يسمح لضوء خارج التركيز من الألياف المحيطة بها لبالمرور إلى كاشف. لتطبيقات التصوير المختلفة ، يمكن إضافة مجموعة من العدسات على الحافة البعيدة للسماح إلى الأمام التي تواجه ، والتصوير مضان لمسافات طويلة. ويمكن بسهولة العدسات Microoptic ، فضلا عن التدرج الإنكسار (غرين) العدسات يمكن تكييفها لهذا الاستخدام ، ويمكن اضافته الى الطرف البعيد باستخدام الألياف البصرية نوعية المواد اللاصقة. لإعداد نظام التصوير عن microendoscopy ، إزالة بعناية المرحلة العينة واستبداله الألياف عقد المرحلة (الشكل 5). تراجع انهاء واحدة من حزمة من الألياف في حل ضعف صبغ حتى يتم إنشاء تلك الانبعاثات مضان بالتساوي على كل من النوى الألياف. بدوره على نظام المسح الضوئي وضبط حامل الألياف لجعل الطرف الآخر من حزمة من الألياف (النهاية القريبة ، أو أقرب إلى نهاية البصريات المجهر) في التركيز. أولا ، استخدام الترجمة التكيف SCREWS إلى مركز الألياف في مجال مسحها. الآن ، تبدو في صورة الانبعاثات مضان من طرف الألياف القريبة في حين المسح. عند السطح microendoscope كاملة في الطائرة البؤرية لهذا الهدف ، فإن الانبعاثات مضان في جميع النوى الألياف تكون موحدة قدر الإمكان. استخدام المقابض التكيف الزاوية لضبط الألياف الوجه لجعل جميع النوى الألياف مشرق بالتساوي. خلال هذا التعديل ، فإنه من المرجح أن تكون ضرورية لإعادة ضبط موضع الترجمة لإعادة مركز الألياف في مجال مسحها. iterate خلال هذه التعديلات حتى غيض من الألياف كله صحيح في التركيز. قبل استخدام microendoscope ونظيفة بلطف غيض البعيدة باستخدام ورقة عدسة تنظيف مرطبة قليلا مع HPLC الصف الميثانول. كما كان من قبل ، واستخدام معيار لقياس حجم المعروفة وحساب قرار microendoscope نظام التصوير. 6. ممثل النتائج : ويبين الشكل 6 مثال على الانتهاء من الاستعراض الدوري الشاملight مجهر المسح مبائر تكوين microendoscopy. وقد وضعت أشعة الليزر والانبعاث كدليل للعين. جبل الألياف يحمل صورة في مكان الألياف خلال العملية microendoscopy. ويمكن استبدال هذه الألياف جبل بسهولة مع XY أو XYZ مرحلة الترجمة لاستخدامها كمنصة المجهر تستقيم. قطع مكدسة ThorLabs PT3 (XYZ الترجمة) أو اثنين PT1 مراحل (XY الترجمة) تعمل بشكل جيد لهذا التطبيق ، جنبا إلى جنب مع قوس الزاوية اليمنى مثل جزء ThorLabs AP90. يستخدم بطاقة الفيديو framegrabber معدل لتوليد الصور من إشارة واردة. ويبين الشكل 7 صورة اختبار الممثلة المأخوذة من حالة انخفاض "م" المطبوعة على بطاقة بيضاء الأعمال باستخدام نظام الفيديو المجهر معدل المسح. ورقة بيضاء ابيض يحتوي fluorophores التي ولع ضوء الأشعة فوق البنفسجية والزرقاء ، مما أدى إلى خلفية ساطعة وراء الرسالة الظلام "م". وقد تم اختيار عامل تصفية تركز الانبعاثات في 515 نانومتر لجمع هذه الانبعاثات الفلورسنت. ألف مويمكن ملاحظة inor تشويه للصورة ، لا سيما بالقرب من حواف جانبية للإطار الصورة. وستناقش هذه النتائج من تشويه نمط المسح الجيبية المرآة gavlo 8kHz ، وبالتفصيل أدناه. الشكل 1. مخطط يدل على المبدأ الأساسي في تشغيل المجهر متحد البؤر. يتم ترحيل الأشعة القادمة من التركيز الهدف مرة أخرى من خلال النظام ، وركزت من خلال الثقب مبائر (الحمراء). لا تنشأ الأشعة فوق إما (الأزرق) أو أقل (الأخضر) التركيز الهدف لا يخرج عن الهدف موازى ، وبالتالي تنتقل بكفاءة من خلال الثقب مبائر. الشكل 2. مخطط يبين جميع المسارات شعاع الضوء من خلال نظام المسح الضوئي. المرايا المسح الجلوس في الطائرات telecentric مع ستاtionary ، والفتحة مرة أخرى الهدف الطائرة. أزواج من العدسات بين طائرات ثابتة تعمل على ترحيل الحزم فحصها. أول اثنين من العدسات وأطوال تتابع التنسيق على قدم المساواة ، وتشكيل تلسكوب 1:1. الزوج الثاني من العدسات ، والمعروفة رسميا باسم عدسة المسح الضوئي وعدسة أنبوب ، لا تحتاج إلى أن تكون متساوية في البعد البؤري ، وغالبا ما تخدم تلسكوب توسيع شعاع لضمان الهدف هو مملوء الظهير الفتحة. الضوء المنبعث من العينة يسافر مرة أخرى من خلال نظام المسح الضوئي ويتم تمريرها من خلال المرآة مزدوج اللون. عدسة التركيز قصير يركز على ضوء الانبعاثات من خلال الثقب مبائر ، وهو موازى ثم بواسطة العدسة. عدسة النهائي يركز انبعاث مبائر – تصفيتها على أنبوب مضخم. اضغط هنا للاطلاع على نسخة كاملة الحجم لهذه الصورة. <img src="/files/ftp_upload/3252/3252fig3b.jpg" aلتر = "3B الشكل" /> الشكل 3 (أ) رسم تخطيطي لمحة عامة عن الإعداد الالكترونيات المسح. إشارة مرجعية لالمجهر الشاملة وtimebase هو "متزامنة" إخراج TTL المرآة محور galvo سريع الرنانة ، والذي يولد النبض TTL في نهاية كل سطر تفحص (أي عندما galvo اكتمال دورة المسح). يوفر هذا إشارة إلى H – مزامنة بطاقة framegrabber. يرتبط أيضا إخراج galvo لمزامنة لوحة التحكم V – متزامنة ، مما يزيد تدريجيا الجهد انتاجها ردا على كل نبضة H – مزامنة لتوليد الموجي مشرشف مثل سن المنشار الذي يدفع محور المسح بطيئة. مرة واحدة وقد تم مسح جميع الخطوط ، V – مزامنة إعادة تعيين مجلس الموجي مشرشف مثل سن المنشار ويولد النبض TTL التي هي بمثابة إشارة V – مزامنة لframegrabber. الإدخال النهائية على بطاقة framegrabber هو إشارة تناظرية من أنبوب مضخم (لاحظ أن العديد من فرق إدارة المشاريع PMT توليد السلبية انتاج التيار الكهربائي ، يجب التأكد من تصميم الدوائر يدكد اختيار الجهاز تبعا لذلك). يتم إنشاء صور الفيديو معدل وعرضها في برنامج framegrabber MATROX. (ب) دائرة مثال السيطرة. في هذا التصميم ، هو "واضاف" في كل نبضة من الجهد H – مزامنة / المتكاملة على تكامل المرجع أمبير لإنشاء منحدر الموجي مشرشف مثل سن المنشار ؛ تحسب نبضات متزامنة في مرحلة مواجهة TTL. عندما تم الوصول إلى الرقم المطلوب من خطوط (أي عند اكتمال التفحص النقطية) ، العداد يولد نشط منخفضة "تنفيذ" النبض ، مما يدفع المشغل شميت لتوليد نبضة لإعادة تكامل. هذا يعيد تعيين كل من المضاد وتكامل المرجع أمبير ، تستعد حلبة للدورة المقبلة. اختيار العنصر المناسب يجعل هذه الدائرة المطبقة على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الأحجام النقطية. هذا هو واحد فقط التنفيذ ؛ تطبيقات أخرى عديدة ممكنة ، وربما يكون من المفضل في ظل ظروف معينة. أيضا ، تم تصميم هذه الدائرة للاستخدام مع بطاقة framegrabber MATROXق ، والذي كشف عن وتصحيح صورة المرحلة تلقائيا. إذا كانت الدائرة هي لاستخدامه مع framegrabbers أخرى ، قد تكون هناك حاجة مرحلة تصحيح الدوائر أو البرامج. انقر هنا لعرض النسخة الكاملة الحجم لهذه الصورة. نقل صورة شخصية 4. من خلال حزمة من الألياف متماسكة. في هذا التخطيطي ، العدسات على جانبي حزمة موجودة على نطاق كل من الصورة المسقطة على إدخال حزمة من الألياف وكذا توسيع الصورة على إخراج حزمة الألياف. الشكل 5. مثال على حزمة الألياف التي تقام في جبل 5 – المحور. كان يشعر بالملل صغيرة قطرها الالومنيوم 1 "كتلة بحيث يمكن إدراج حزمة الألياف الصورة. وكان epoxied الألياف داخل كتلة الألومنيوم في بوتح أعلى وأسفل من كتلة لتحقيق الاستقرار. الشكل 6. صورة النظام المجهري مع الانتهاء من microendoscope المرفقة. لتصور أفضل لمسارات الضوء ، ويوجه مسار شعاع الإثارة في الزرقاء ، في حين يوجه مسار شعاع الانبعاثات بعد المرآة مزدوج اللون كخط أحمر. الرقم 7. صورة مثال إنشاؤها بواسطة الفيديو معدل مبائر نظام المسح المجهري. مظلم خطاب حالة السفلية "م" على خلفية مشرق مضان من بطاقة أعمال البيضاء.

Discussion

هذا النظام التصوير بالفيديو معدل يجعل من استخدام نظام تشغيل مرآة galvanometric مدوية في حوالي 8 كيلو هرتز. يمكن أن يكون مرتفعا المرايا مدوية للغاية عندما يعمل في السلطة الكاملة ، والملعب العالية يمكن أن تكون مزعجة أو خطيرة حتى في أوقات التعرض كافية. وإن لم يثبت هنا ، فمن المستحسن لحماية المرآة galvanometric مدوية داخل حقيبة شفافة لخفض كبير في حجم النظام و / أو العتاد المناسب لارتداء السمع وقائية ، مثل سدادات الأذن.

المرآة galvanometric بفحص الرنين في نمط الجيبية. ومع ذلك ، وبطاقات framegrabber قراءة في إشارة بافتراض معدل اكتساح خطية تماما في كلا الاتجاهين الأفقي والرأسي. منذ الاجتياح الجيبية يبطئ على حواف الفحص ، يمكن ملاحظة الآثار ضغط الصور على طول محور سريع صورة (أفقي). طريقة واحدة للحد من هذه المشكلة هو محرك عمدا المرآة galvo الرنانة نطاق المسح أكبر بكثير منتتابع عدسة القطر. في القيام بذلك ، لن يؤدي إلا إلى ما يقرب من الاجتياح خطية المركزية لفحص نمط الجيبية تجتاز العينة ، والتقليل من تشوهات الصورة. ونهج آخر يتمثل في ما بعد عملية الصور التي تم جمعها ليصبح خطي المحور بسرعة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التصوير نمط معروف الفلورية (مثل الشبكة) وباستخدام مقاييس معروفة لخلق نمط نصي unwarps تجهيز الصور التي تم جمعها.

وقد صمم هذا النظام مسح خاص لهذا الغرض من التصوير في الجسم الحي ، والتي غالبا ما يتطلب التوجه تستقيم الفيديو معدل المجهر. للتجارب التصوير الخلوية ، وعادة ما تستخدم أكثر المجاهر المقلوب. ويمكن تصميم المقدمة هنا تغييرها بسهولة لبناء مثل هذا المجهر المقلوب ، وكل ما هو مطلوب هو تناوب المباراة النهائية 2 مرآة قطرها ". بدلا من توجيه المرآة لتوجيه شعاع المسح الهبوط ، يمكن للمرآة توجيه شعاع التصاعدي. وضع عدسة هدفر وعلى مسافة واحدة من المرآة جنبا إلى جنب مع مرحلة عينة تسمح للتصوير في الهندسة مقلوب. إذا كان يتم بناء نظام التصوير لمجرد التصوير microendoscopic ، ليس هناك سبب يدعو إلى "اضعاف" تصميم المجهر عموديا على الإطلاق. بدلا من ذلك ، يمكن أن يبنى نظام مسح كامل على اللوح أفقي واحد مع الهدف الموازي عدسة موجهة الى طاولة الضوئية.

علما بأن هذا المجهر في بناء التكوين يستخدم الثقب الثابتة ، في حين أن هذا ينص على بناء أكبر بساطة وسهولة التنسيق والمستخدمين الراغبين نظام أكثر تنوعا قد تنظر في إدراج متغير ذات الثقب ، كما يمكن العثور عليها في معظم المجاهر مبائر التجارية. عن طريق السماح للمستخدم لضبط حجم ثقب الدبوس للتعويض عن عينات من كثافة الانبعاثات متفاوتة ، وهذا يسمح للمستخدم لتحسين أفضل لالمفاضلة بين القوة والقرار إشارة لعينة معينة.

في الفصلoice من الألياف الصور المختارة للمجهر هو المهم. ونحن نوصي باستخدام الألياف سوميتومو صورة متماسكة نظرا لتباعد الوثيق بينهما الألياف الأساسية وتألق ذاتي نسبي منخفض. تم العثور على صورة ألياف صنعت من قبل فوجيكورا لكميات عالية من تألق ذاتي ¹⁰ ، والتي يمكن أن تطغى على إشارات ضعيفة مضان من عينة والحد من حساسية النهائي للmicroendoscope. سوميتومو الألياف المصنعة ، مثل 30N – 8 المستخدمة في هذا الإعداد وجه الخصوص ، لديهم مستويات أقل بكثير من تألق ذاتي معادلاتها فوجيكورا. في حين يمكن اعتبار حزم الألياف يتشيد جذابة للmicroendoscopy ، تصميمها عادة الأماكن النوى الألياف الفردية متباعدة جدا ، وهذا يعني أن الألياف النوى الكائنات عينة قليلة ، تاركة مناطق كبيرة من الفائدة المحتملة.

أخيرا ، تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن المجهر الموصوفة هنا سيكون مفيدا في مجموعة متنوعة من في المختبر والمجراة للتطبيقيمكن خلق الوظائف ولجزء من تكلفة نظام كامل المواصفات التجارية ، وأنها لا تملك ميزات مثل الكشف عن الضوء المرسل ، والعدسة للعرض ، أو مسار شعاع لepifluorescence widefield غير متحد البؤر. في حين أنه من الممكن بناء نظام مع هذه الميزات من الصفر ، ويمكن للقراء الراغبين مثل هذا النظام ترغب في تعديل نظام قائم التجارية لتلبية احتياجاتهم بدلا من الشروع في بناء جديد تماما.

Materials

Part Name	Manufacturer	Item Number	Specifications	Quantity
515 nm Band Pass Filter	Chroma	HQ515/50M	46 FWHM	1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-766		1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-768		1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-769		2
Achromatic Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT45-179		1
8 kHz R High Frequency Optical Scanner	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	SC-30	8 kHz	1
AGC Driver	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	ACG:8K
H7422-PA Photosensor Module	Hamamatsu	H7422-PA	Current limiting recommended	1
M9012 Power Supply	Hamamatsu	M9012	For use with H7422-PA	1
HC PL APO CS Objective	Leica	11506284	10x/0.40	1
Solios eA/XA Framegrabber Card	Matrox	Solios eA/XA	MIL software required; OEM interconnects recommended	1
12V Power Supply	Meanwell	LPV-100-12	+12V, 8.5A	1
5x Microscope Objective Lens	Newport	M-5X	0.10 NA, 25.4 mm Focal Length	1
Coherent Image Fiber	Sumitomo	8-30N		1
1/4″-20 Cap Screw and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT2		1
100 μm Mounted Pinhole	ThorLabs	P100S	Ideal for building spatial filters	1
30 mm Cage Cube Clamp	ThorLabs	B6C		1
30 mm Cage System Cube, 4-Way	ThorLabs	C4W		1
406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber Pigtailed Laser Diode, FC/PC	ThorLabs	LPS-406-FC	Product obsolete; replaced by LP405-SF10	1
5-Minute Epoxy, 1 Ounce	ThorLabs	G14250		1
6 Axis Kinematic Optic Mount	ThorLabs	K6X		1
8-32 Cap Screw and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT1		1
8-32 Setscrew and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT3		1
Adapter with External RMS Threads and Internal SM1 Threads	ThorLabs	SM1A4		1
Adj. FC/PC and FC/APC Collimator, f = 2.0 mm, ARC: 400-600 nm	ThorLabs	CFC-2X-A	f = 2.0 mm	1
Adjustable Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded	ThorLabs	AD9.5F		1
Aluminum Breadboard, 12″ x 18″ x 1/2″	ThorLabs	MB1218	1/4″-20 Threaded	2
Benchtop Laser Diode/TEC Controller	ThorLabs	ITC4001	1 A/96 W	1
DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror	ThorLabs	DMLP425		1
Kinematic Mount for Ø1″ Optics	ThorLabs	KM100		3
LD/TEC Mount for ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser Diodes	ThorLabs	LM9LP		1
Lens Mount for Ø18 mm Optics	ThorLabs	LMR18	One retaining ring included	1
Lens Mounts for 2″ Optics	ThorLabs	LMR2S	With internal and external threading; retainer ring included	2
Mini Series Cage Assembly Rod, 6″ Long, Ø4 mm, Qty. 1	ThorLabs	SR6		4
Ø1.0″ Pedestal Pillar Post, 8-32 Taps, 1″ Long	ThorLabs	RS1P8E		4
Ø1″ Pillar Post Extension, Length=0.5	ThorLabs	RS05		4
Ø1″ Pillar Post Extension, Length=0.75″	ThorLabs	RS075		4
Ø1″ Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	ThorLabs	ME1-P01		1
Ø1″ SM1 Rotating Adjustable Focusing Element, L = 1″	ThorLabs	SM1V10		1
Ø2″ Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	ThorLabs	ME2-P01		2
P100S – Ø100 μm Mounted Pinhole	ThorLabs	P100S		1
Polaris Low Drift Ø1″ Kinematic Mirror Mount	ThorLabs	POLARIS-K1	Low drift	1
SM1 Lens Tube, L = 1″	ThorLabs	SM1L-10	One retaining ring included	4
SM1 Threaded 30 mm Cage Plate, 0.35″ Thick	ThorLabs	CP02		2
SM1 to M25 Optical Component Threading Adaptor	ThorLabs	SM1A24	External SM1 Threads and Internal M25.5×0.5 Threads	1
Small Beam Diameter Galvo System	ThorLabs	GVSM001		1
Small Clamping Fork	ThorLabs	CF125	1/25″ counterbored slot, universal	15
Spatial Filter System	ThorLabs	KT310	Pinhole sold separately	1
TE-Cooled Mount for 5.6 & 9 mm Lasers	ThorLabs	TCLDM9		1
Vertical Bracket for Breadboards	ThorLabs	VB01	Each	2
Plan-Apochromat	Zeiss	1101-957	20x/0.75 NA	1