Summary
DT40, एक मॉडल हड्डीवाला आनुवंशिक प्रणाली, प्रोटीन समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. यहाँ हम एक सरल तरीका है कि पैरामीटर है कि एक अणु के स्तर पर DT40 कोशिकाओं में एस चरण के दौरान डीएनए संश्लेषण को प्रभावित करने के गुणात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है का वर्णन.
Protocol
विधि यहाँ वर्णित निम्नलिखित प्रकाशन में इस्तेमाल किया गया था: श्वाब एट अल, EMBO जे, 29 (4) 5 :806- 18.
1. DT40 सेल संस्कृति
सामग्री: भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, चिकन सीरम, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2-mercaptoethanol RPMI
- सेल संस्कृति माध्यम तैयार: 7% FBS जोड़ने के लिए, 3% चिकन सीरम, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10 सुक्ष्ममापी 2 mercaptoethanol RPMI मध्यम.
- DT40 कोशिकाओं बाँझ सेल संस्कृति बोतल में 38 बड़े हो रहे हैं डिग्री सेल्सियस और 5% एक humidified इनक्यूबेटर में सीओ 2. कोशिकाओं भाजित हर दिन 5 10 5 कोशिकाओं / x 6 मिलीलीटर की एक घनत्व.
2. Vivo लेबलिंग में
सामग्री: IDU, CldU
- Nucleotide analogues के स्टॉक समाधान तैयार: 5 मिमी और CldU IDU माध्यम में 2.5 मिमी को भंग. संक्षेप में 60 दोनों के समाधान हीट डिग्री सेल्सियस और nucleotide अनुरूप जब तक भंवरues पूरी तरह भंग कर रहे हैं.
- 25 सुक्ष्ममापी के लिए तेजी DT40 कोशिकाओं से बढ़ के एक अंतिम एकाग्रता IDU को जोड़ें और सेल निलंबन मिश्रण अच्छी तरह से. 20 मिनट के लिए 38 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 कोशिकाओं सेते हैं.
- पहले लेबल के साथ ऊष्मायन के बाद, CldU 250 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ सकते हैं और कोशिकाओं का इलाज के रूप में पिछले चरण में वर्णित है.
- बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो और उन्हें 7.5 x 10 5 कोशिकाओं / ठंडा पीबीएस में मिलीलीटर की एक एकाग्रता में resuspend. बर्फ पर लेबल कोशिकाओं रखें.
लेबलिंग वर्णित प्रक्रिया महज एक सुझाव है और विशिष्ट सवालों का पता करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. प्रयोगात्मक डिजाइन पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
3. सेल lysis और डीएनए फैल
सामग्री: ग्लास स्लाइड्स, फाइबर lysis समाधान
- 200 मिमी Tris - एचसीएल, 7.5 पीएच में 50 मिमी EDTA और 0.5% एसडीएस: फाइबर lysis समाधान तैयार
- सेल निलंबन के शीर्ष पर Pipet 7 μl lysis समाधान और धीरे विंदुक टिप के समाधान के मिश्रण के साथ हलचल. सेल lysis के लिए आगे बढ़ना के लिए 2 मिनट के लिए सेते हैं.
- 15 ° करने के लिए स्लाइड्स झुकाएँ फाइबर स्लाइड के साथ प्रसार करने की अनुमति है.
- एक बार फाइबर समाधान स्लाइड के नीचे पहुँच गया है, यह क्षैतिज जगह हवा सूखी. सूखने के बाद, एक पतली, अपारदर्शी लाइन स्लाइड के साथ दिखाई जानी चाहिए. इस बिंदु पर, बढ़ाकर फाइबर की शुरुआत के रूप में धुंधला लाइन अब किसी भी दृश्य नहीं किया जाएगा के बाद एक पेंसिल के साथ चिह्नित किया जाना चाहिए. इस चिह्न के बाद खुर्दबीन के नीचे फाइबर का पता लगाने में मदद मिलेगी.
4. Immunofluorescence धुंधला हो जाना
सामग्री: मेथनॉल, एसिटिक एसिड, एचसीएल, पीबीएस में 5% BSA, धुंधला जार, विरोधी BrdU एंटीबॉडी (माउस),विरोधी BrdU (चूहा) एंटीबॉडी, भेड़ विरोधी माउस Cy3 एंटीबॉडी, बकरी विरोधी चूहे Alexa Fluor 488 एंटीबॉडी, Vectashield बढ़ते मध्यम, coverslips, नेल पॉलिश
- मेथनॉल / एक धुंधला हो जाना और 10 मिनट के लिए जार सेते में एसिटिक एसिड (3:1) में विसर्जित स्लाइड.
- आसुत एच 2 हे में स्लाइड्स, तो 80 मिनट के लिए 2.5 एम एचसीएल में विसर्जित धो लें.
- धो PBS में 5 मिनट के लिए तीन बार स्लाइड.
- धुंधला जार से स्लाइड्स निकालें और एक कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त पीबीएस इकट्ठा. स्लाइड्स क्षैतिज प्लेस और pipet प्रत्येक स्लाइड के शीर्ष पर 5% BSA. स्लाइड्स धीरे coverslip साथ BSA समान रूप से स्लाइड पर और 20 मिनट के लिए सेते फैल कवर.
- 01:25 (माउस) विरोधी BrdU और 1:400 विरोधी BrdU (चूहा): निम्नलिखित सांद्रता में 5% BSA में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला.
- Coverslip धीरे गिलास स्लाइड के नीचे करने के लिए इसे हटाने के लिए ले जाएँ. बल लागू अगर कवर पर्ची स्लाइड से चिपक मत करो. स्लाइड पीबीएस में rehydrated किया जा सकता है जब तक coverslip एक ढीला हो जाता हैघ आसानी से हटाया जा सकता है है. एक कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त BSA लीजिए और स्लाइड क्षैतिज जगह है. Pipet प्रत्येक स्लाइड पर 50 प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के μl. फिर से एक coverslip साथ कवर एंटीबॉडी समाधान समान रूप से स्लाइड से अधिक और 2 घंटे के लिए एक humidified कक्ष में फैल सेते हैं.
- Coverslips हटाने के बाद, 5 मिनट के लिए स्लाइड्स में तीन बार धो PBS
- 1:500 विरोधी माउस भेड़ बकरी Cy3 और 1:400 विरोधी चूहा Alexa 488 Fluor: निम्नलिखित सांद्रता में 5% BSA में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला.
- माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए वर्णित समाधान के 50 μl लागू करें. प्रकाश और 1 घंटे के लिए सेते से स्लाइड्स को सुरक्षित रखें.
- Coverslips हटाने के बाद, स्लाइड 5 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार धो लो.
- प्रत्येक स्लाइड पर Vectashield बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ें और एक coverslip लागू. धीरे coverslips दबाएँ और इसके चारों ओर एक कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने. पारदर्शी नाखून polis के साथ सील coverslipsदो घंटे और उन्हें सूखी. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स स्टोर
5. छवि अधिग्रहण
सामग्री: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, कैमरा ,
एक पेंसिल निशान के करीब स्लाइड पर विसर्जन के तेल की एक बूंद प्लेस और फाइबर का पता लगाने शुरू. आमतौर पर, वहाँ एक मुख्य फाइबर बंडल है, लेकिन इन तंतुओं भी उलझ रहे हैं और विश्लेषण नहीं किया जा सकता है बाद में है. क्षेत्रों में जहां फाइबर स्पष्ट रूप से एक दूसरे (छवि 2) से अलग कर रहे हैं खोजने के मुख्य बंडल से दूर हटो. हम चित्रों का चयन केवल एक ही रंग चैनल का उपयोग क्रम में पूर्वाग्रह से बचने होगा. फिर, हम हर बार बिंदु एकाग्रता, या सेल लाइन के लगभग 10 तस्वीरें ले जाएगा. हालांकि, चित्रों की संख्या कितने फाइबर प्रत्येक चित्र पर गिना जा सकता है है पर निर्भर करता है. स्लाइड के साथ स्थानांतरित करने के लिए अलग अलग तस्वीरें ले, किसी स्लाइड के एक क्षेत्र के रूप में प्रतिनिधि फाइबर लंबाई या प्रतिकृति संरचनाओं नहीं प्रदान कर सकता है.
6. डेटा विश्लेषण
(:> "jove_content" सामग्री http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
एक तस्वीर विश्लेषण प्रोग्राम में चित्रों को आयात करें. फाइबर इलाकों और / की लंबाई का उपाय या गिनती अलग प्रतिकृति संरचनाओं (चित्र 3). केवल गिनती फाइबर है जो स्पष्ट रूप से दिखाई देता है और जो चित्र के किनारे पर विस्तार नहीं कर रहे हैं. हम आमतौर पर के बारे में 100 फाइबर लंबाई मापने के लिए और गिनती 150-200 प्रतिकृति संरचनाओं और हम अलग - अलग प्रयोगों में कम से कम तीन बार दोहराना होगा.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
नवनियुक्त दोहराया डीएनए एंटीबॉडी लेबल nucleotide analogues के लाइनों के रूप में visualized किया जा सकता. हमारे प्रयोगों में चल रहे एक कांटा आसन्न लाल और हरे रंग संकेतों (चित्र 3) के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. डबल लेबलिंग प्रोटोकॉल भी हमें प्रतिकृति संरचनाओं के चार प्रमुख वर्गों को परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है: 1) नई दीक्षा घटनाओं divid किया जा सकता है एड में मूल है कि निकाल दिया गया है जबकि कोशिकाओं को पहले लेबल और मूल है कि दूसरे लेबल के साथ ऊष्मायन के दौरान निकाल दिया है के साथ incubated रहे थे. पूर्व पड़ोसी हरी लाल हरे संकेतों और एक हरे रंग की लाइन के बाद से मिलकर बनता है. ) 2 समाप्ति घटनाओं आसपास के लाल - हरी लाल संकेतों के रूप में प्रकट. 3) interspersed मूल निकट दूरी मूल के साथ जीनोम में साइटों रहे हैं. ऐसी साइटों लगातार मूल और समाप्ति संकेतों से मिलकर बनता है. 4) प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, रुक / ढह कांटे या तो एक लाल केवल 7 संकेत या एक लाल एक छोटी हरी 8,9 पथ द्वारा पीछा लाइन के रूप में परिभाषित किया जा सकता.
यहाँ वर्णित शर्तों का प्रयोग, जंगली प्रकार DT40 कोशिकाओं 0.4 सुक्ष्ममापी / मिनट की एक औसत गति कांटा है. हम लगभग 63% चल रही कांटे, 10% मूल 16% ठप कांटे (लाल केवल इलाकों), 8% समाप्त और 3% interspersed फाइबर का पता लगा सकते हैं.
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. चित्रा 1 (ए) डीएनए की लेबलिंग प्रक्रिया के कार्टून के बाएं हाथ की की ओर पहला कदम दर्शाया गया है: तेजी से बढ़ रही DT40 कोशिकाओं को IDU जोड़ने nucleotide आसानी से नए संश्लेषित अग्रणी और डीएनए strands ठंड में शामिल किया जा एनालॉग सुराग. यह एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके देखे जा सकते हैं, और एक लाल रेखा के रूप में दिखाई देते हैं जब खुर्दबीन के नीचे देखा. बाद में, उसी प्रक्रिया CldU के साथ दोहराया है के रूप में आंकड़े के सही पक्ष पर दिखाया गया है. दूसरा nucleotide एनालॉग के साथ ऊष्मायन के बाद, एक सक्रिय कांटा एक आसपास लाल हरी पथ के रूप में दिखाई जाएगी. औसत फाइबर लंबाई nucleotide analogues के ऊष्मायन समय के लिए आनुपातिक है. (बी) lysed DT40 कोशिकाओं से डीएनए गंभीरता से एक खुर्दबीन स्लाइड पर फैला है और शामिल nucleotide analogues के विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना कर रहे हैं.
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चित्रा 2 एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवि जंगली प्रकार DT40 बाद में 20 मिनट प्रत्येक के लिए IDU और CldU के साथ लेबल की कोशिकाओं से फाइबर से पता चलता है. फाइबर की सबसे अच्छी तरह से एक दूसरे से अलग हैं और इस तरह आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है. सफेद पट्टी 10 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3 फाइबर डबल लेबलिंग तकनीक एक अलग प्रतिकृति संरचनाओं के बीच भेद करने के लिए अनुमति देता है, 1 - सक्रिय नकल कांटे, 2 - डीएनए प्रतिकृति (नया मूल की फायरिंग), 3 की नई साइट - कांटा समाप्त (दो converging कांटे), 4 - interspersed (निकट दूरी मूल के साइटों) फाइबर और 5 - रुक कांटे (लाल केवल संकेत).
Discussion
हम एक तरीका है कि पैरामीटर है कि एक अणु के स्तर पर एस चरण के दौरान डीएनए संश्लेषण को प्रभावित करने के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है का वर्णन. पिछले दस वर्षों में, डीएनए फाइबर fluorography तकनीक के विभिन्न संस्करणों के लिए जीवित कोशिकाओं के भीतर अलग - अलग प्रतिकृति कांटे की आंदोलन की कल्पना करने के लिए विकसित किए गए. इन सभी तकनीकों में महत्वपूर्ण पैरामीटर कांच अच्छी तरह से अलग डीएनए फाइबर प्रदान सतहों पर डीएनए के सर्वश्रेष्ठ खींच संभव प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lysis समय खुर्दबीन स्लाइड पर सेल निलंबन के ऊष्मायन समय है. इन मानकों और एक विशेष प्रयोगशाला में तापमान airflow पर निर्भर करती है और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. एक डीएनए फाइबर प्रयोग के व्यावहारिक हिस्सा आम तौर पर एक दिन के भीतर पूरा किया है. हालांकि, बाद में चित्र के अधिग्रहण और विश्लेषण और अधिक समय लगता है और अभ्यास की आवश्यकता है.
लेबलिंग प्रोटोकॉल विज्ञापन किया जा सकता हैविभिन्न वैज्ञानिक समस्याओं के जवाब apted: एक एजेंट है कि दूसरी पल्स लेबलिंग के दौरान प्रतिकृति के साथ हस्तक्षेप का उपयोग कर कांटा बढ़ाव / replicative तनाव के जवाब में रोकने पर नज़र रखता है. इस परिदृश्य में, पहले लेबल दूसरा nucleotide के रूप में बाहर धोया जा अधिक की जरूरत नहीं है में जोड़ा जाता है. वैकल्पिक रूप से, दवाओं है कि प्रतिकृति बाधित संयोजन में या बस से पहले लेबल के अलावा के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है. यह पहले लेबल की आवश्यकता होती है और दूसरी nucleotide एनालॉग से पहले हटाया जा दवा लागू किया जाता है. यह प्रक्रिया एक replicative कांटा / replicative तनाव की शर्तों (यानी कांटा रोकने और / या पतन) के तहत स्थिरता वसूली पर विभिन्न डीएनए की मरम्मत कारकों के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. उल्लेखनीय डीएनए प्रतिकृति कार्यक्रम के विवरण की एक अधिक विस्तृत विश्लेषण एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में तलाशी डीएनए और प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण के संयोजन के उपयोग के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है. यह तथापि, तकनीकी और अधिक चुनौतीपूर्ण है और खर्च की आवश्यकताsive उपकरण.
गुणात्मक और मात्रात्मक डीएनए प्रतिकृति के विवरण का विश्लेषण करने की क्षमता ही डीएनए प्रतिकृति में दोष के रूप में के रूप में अच्छी तरह रास्ते में है कि जीनोमिक प्रतिकृति कांटे के साथ जुड़े अस्थिरता को दबाने की जांच के लिए एक आवश्यक उपकरण प्रदान करता है. निस्संदेह, इस परख आगे प्रतिकृति की मध्यस्थता डीएनए की मरम्मत के तंत्र है कि सामान्य कोशिकाओं को जवाब / पर्यावरण परिवर्तन के रूप में कैसे कैंसर की कोशिकाओं को इन तंत्रों का उपयोग करने के लिए प्रतिकृति कांटे लक्ष्यीकरण दवाओं की विषाक्तता का विरोध के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित की अनुमति पर प्रकाश डाला मदद मिलेगी.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम फाइबर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तकनीक उपयोगी चर्चा के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों के साथ मदद के लिए डॉ. टी. Helleday और डॉ. ई. Petermann धन्यवाद. WN एक वरिष्ठ अंतर्राष्ट्रीय कैंसर अनुसंधान के लिए एसोसिएशन से इंटरनेशनल रिसर्च फैलोशिप और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान (१,६५,९३५ N301) पोलिश राज्य समिति द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
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