Summary
DT40, 모델 척추 유전 시스템은 단백질 기능을 분석하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 여기서 우리는 단일 분자 수준에서 DT40 세포에있는 S - 단계에서 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정성 분석을 수있는 간단한 방법을 설명합니다.
Abstract
복제 포크 안정성의 유지 보수 가능성을 유지하고 질병을 방지하기 위해 세포를 분리를위한 최고 중요성이다. 관련된 프로세스는 내생 및 외인성 DNA 손상의 얼굴에 충실한 게놈 복제를 보장뿐만 아니라 게놈 불안정성, 종양 개발에 인정 원인이되는 요인을 방지하지 않습니다.
여기, 우리는 간단하고 비용 효율적인 형광 현미경 기반의 조류 B - 세포주 DT40의 DNA 복제를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 세포 라인 척추 세포 1 리버스 유전학에 의해 생체내 단백질의 기능을 조사하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 특정 유전자를 부족한 DT40 세포의 DNA 섬유 fluorography 하나가 DNA 복제와 게놈 안정성이 유전자 산물의 기능을 명료하게하다 수 있습니다. 척추 세포 복제 포크 역학을 분석하는 전통적인 방법은 펄스 표시된 세포의 인구의 DNA 합성의 전반적인 속도를 측정에 의존. 이것은 양적 접근이며 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정성 분석을 위해 허용하지 않습니다. DNA 섬유 기술 2-4 사용하면 대조적으로, 적극적인 포크의 움직임의 속도는 바로 다음 수 있습니다. 이 방법에서는, 초기 DNA는 할로겐화 세포핵의 결합 (그림 1A)에 의해 생체내에 표시됩니다. 그 후, 각각의 섬유는 현미경 슬라이드에 뻗어 있으며, 레이블이 붙은 DNA 복제 책자는 특정 항체 물들일 및 형광 현미경 (그림의 1B)에 의해 시각입니다. 복제뿐만 아니라 포크 방향의 개시 두 다르게 수정 analogues의 연속 사용에 의해 결정됩니다. 또한, 이중 라벨 부착 방식은 S - 단계에서 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정량 분석을 허용 등 지속 및 지연 포크, 복제 원산지 밀도뿐만 아니라 포크 종단과 같은 즉, 복제 구조. 마지막으로, 실험 절차는 수행할 수 있습니다하루 이내에 에드, 그리고는 일반적인 실험실 장비 및 형광 현미경이 필요합니다.
Protocol
Schwab 외, EMBO J., 29 (4) :806 - 18 5. 방법은 다음과 같은 간행물에 사용되었습니다 여기에 설명되어 있습니다.
1. DT40 세포 배양
자료 : 태아 소 혈청 (FBS), 닭 혈청, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 - 메르 캅 토 에탄올, RPMI
- 세포 배양 매체를 준비 : 7퍼센트 FBS를 추가 3% 닭 혈청, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 μm의 2 - 메르 캅 토 에탄올 RPMI 매체 있습니다.
- DT40 세포가 38 세에 무균 세포 배양 flasks에서 재배 ° C, 5 % 나 humidified 인큐베이터에서 CO 2. 5 × 10 5 세포 / ML 6 밀도 매일 세포를 분할.
2. 생체내 라벨에서
자료 : 이두, CldU
- 뉴클레오 티드 analogues의 재고 솔루션을 준비 : 중간 2.5 MM 5 MM과 CldU에 이두를 해산. 간단히 60 두 솔루션을 열 ° C와 뉴클레오 티드 아날로그까지 소용돌이ues 완전히 녹아있다.
- 기하 급수적으로 DT40 세포 성장을 25 μm의의 최종 농도 이두를 추가하고 잘 세포 현탁액을 섞는다. 38 ° C와 5% CO 2에서 20 분 동안 세포를 품어.
- 첫 번째 레이블이있는 부화 후, 250 μm의의 최종 농도 CldU을 추가하고 이전 단계에서 설명한대로 세포를 처리합니다.
- 얼음 차가운 PBS로 세포를 씻어 및 7.5 × 10 5 세포 / 차가운 PBS에서 ML의 농도에 그들을 resuspend. 얼음에 표시된 세포 보관하십시오.
설명 라벨 절차는 단순히 제안하고 구체적인 질문을 해결하기 위해 수정할 수 있습니다. 실험 설계에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
3. 확산 세포 용해와 DNA
재료 : 유리 슬라이드, 섬유 용해 용액
- 200 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5에서 50 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 0.5 % SDS : 섬유 용해 용액 준비
- Pipet 7 μl 용해 세포 현탁액 위에 솔루션과 부드럽게 솔루션을 혼합하는 피펫 팁 함께 저어. 진행 세포 용해 2 분 동안 품어.
- 섬유는 슬라이드를 따라 확산 수 있도록 15 °로 슬라이드를 기울.
- 섬유 솔루션은 슬라이드의 하단에 도달되면, 공기 건조에 수평으로 그것을 놓으십시오. 건조 후, 얇은, 불투명한 라인은 슬라이드 따라 표시되어야합니다. 이 시점에서 뻗어 섬유의 시작은 라인이 더 이상 표시되지 않습니다 얼룩 이후로 연필로 표시한다. 이 마크는 나중에 현미경으로 섬유를 찾습니다 도움이 될 것입니다.
4. Immunofluorescence 염색법
자료 : 메탄올, 초산, HCL, PBS에서 5 % BSA, 얼룩 병, 안티 - BrdU (마우스) 항체,안티 BrdU (쥐) 항체, 양 반 마우스 Cy3 항체, 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 항체, Vectashield 장착 매체, coverslips, 매니큐어
- 메탄올 / 10 분 얼룩 병 및 부화에 초산 (3시 1분)에 빠져 슬라이드.
- 80분 2.5 M HCL에 다음 젖어 소주 H 2 O에서 슬라이드를 씻으십시오.
- 워시는 5 분 동안 PBS로 세 번 슬라이드.
- 얼룩의 항아리에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 여분의 PBS를 수집합니다. 수평 슬라이드를 놓고 각 슬라이드의 상단에 pipet 5 % BSA. 슬라이드 위에 균일하게 BSA를 확산하고 20 분 동안 부화 coverslip와 함께 부드럽게 슬라이드를 커버.
- 1시 25분 안티 BrdU (마우스)와 1:400 안티 BrdU (쥐) : 다음과 같은 농도에서 5 % BSA의 기본 항체를 희석.
- 그것을 제거하는 유리 슬라이드 아래로 부드럽게 coverslip를 이동합니다. 커버 슬립이 슬라이드 경우엔 힘을 적용하지 마십시오. coverslip 줄을 될 때까지 슬라이드는 PBS에 rehydrated 수 있습니다D는 쉽게 제거할 수 있습니다. 종이 타월로 여분의 BSA를 수집하고 가로 슬라이드를 삽입합니다. 각 슬라이드에 기본 항체 솔루션의 Pipet 50 μl. 슬라이드 위에 균일하게 항체 솔루션을 확산하고 2 시간 동안 humidified 챔버에서 부화 coverslip로 다시 커버.
- coverslips을 제거한 후 5 분 슬라이드에게 PBS로 세 번 씻어
- 1:500 양 반 마우스 Cy3와 1:400 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 다음 농도에서 5 % BSA의 보조 항체를 희석.
- 로 기본 항체에 대한 설명 보조 항체 용액 50 μl를 적용합니다. 1 시간 동안 조명과 부화에서 슬라이드를 보호합니다.
- coverslips을 제거한 후 5 분 슬라이드에게 PBS로 세 번 씻는다.
- 각 슬라이드에 Vectashield 장착 매체의 한 방울을 추가하고 coverslip을 적용합니다. 부드럽게 coverslips을 누르면 종이 타월로 여분의 주위에 액체를 제거합니다. 투명 손톱 polis과 인감 coverslips그들이 건조 H 및하자. -20 ° C.에있는 슬라이드를 저장
5. 이미지 수집
재료 : 형광 현미경, 카메라
연필 표시에 가까운 슬라이드에 침지 기름 한 방울을 장소와 섬유를 찾기 시작합니다. 일반적으로, 그곳에서 주요 섬유 번들이지만,이 섬유가 너무 얽혀 버린하고 나중에 분석할 수 없습니다. 섬유가 명확하게 (그림 2) 서로 분리 영역을 찾기 위해 멀리 기본 번들에서 이동합니다. 우리는 편견을 피하기 위해 한 색상 채널을 사용하여 사진을 선택합니다. 그렇다면, 우리는 매번 포인트, 집중력 또는 셀 라인의 약 10 사진을 찍는 것입니다. 그러나 사진의 숫자는 각 사진에 계산 수있는 얼마나 많은 섬유에 따라 달라집니다. 슬라이드 중 하나가 지역 대표 섬유 길이 또는 복제 구조를 제공하지 수 있으므로, 다른 사진을 찍을 수있는 슬라이드를 따라 이동합니다.
6. 데이터 분석
재료 : 그림 분석 프로그램, 예를 들어 ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
사진 분석 프로그램에 사진을 가져옵니다. 섬유 책자 및 / 길이를 측정하거나 (그림 3) 서로 다른 복제 구조를 계산합니다. 단지 그림의 가장자리를 통해 연장하지 명확하게 표시하고있는 아르 섬유를 계산합니다. 우리는 일반적으로 약 100 섬유의 길이를 측정하고 150-200 복제 구조를 계산하고 우리는 각각의 실험에 적어도 세 번 반복합니다.
7. 대표 결과 :
새로 복제된 DNA는 항체 - 레이블 염기 analogues의 라인으로 시각하실 수 있습니다. 우리의 실험에서 지속적인 분기점이 인접 빨간색과 초록색 신호 (그림 3)로 표현된다. 이중 레이블 프로토콜은 또한 우리가 복제 구조의 네 개의 주요 클래스를 정의할 수 있습니다 : 1) 새로운 초기화 이벤트가 divid 수 있습니다 세포가 처음으로 라벨과 두 번째 레이블 인큐베이션 기간 동안 해고 기원 incubated 동안 해고 기원에 에드. 전자 인근 녹색 빨강 - 녹색 신호와 녹색 라인만을 후기 구성되어 있습니다. 2) 종료 이벤트는 인접한 빨강 - 녹색 - 빨간색 신호로 명단. 3) interspersed 기원이 붙어 기원과 게놈의 사이트입니다. 이러한 사이트는 연속 기원과 종료 신호로 구성됩니다. 4) 지연 / 붕괴 포크는 하나만을 빨간 신호를 7 또는 짧은 녹색 넓이 8,9 다음 붉은 선으로 정의 될 수 실험 설계에 따라 다릅니다.
조건을 사용하면 야생 유형 DT40 세포가 0.4 μm의 / 분 평균 포크 속도를 가지고, 여기에 설명되어 있습니다. 우리는 약 63%에게 지속적인 포크, 10 % 기원, 16% 지연 포크 (적색 전용 책자), 8 % 종단 3 % interspersed 섬유를 검색할 수 있습니다.
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. 그림 1 (A) 만화의 왼쪽은 DNA 라벨 절차의 첫 단계를 묘사 : 기하 급수적으로 증가하고 DT40 세포 이두를 추가하면 즉시 새로 합성 선도와 DNA의 긴 보온에 통합될 수있는 뉴클레오 티드 아날로그을 주도하고 있습니다. 이것은 특정 항체를 사용하여 시각 수 있으며, 현미경으로 볼 때 붉은 선으로 나타납니다. 그림의 오른쪽에있는 그림과 같이 그 후, 동일한 절차 CldU로 반복됩니다. 두 번째 뉴클레오 티드 아날로그와 부화 후, 적극적인 포크 인접한 빨강 - 녹색 넓이로 표시됩니다. 평균 섬유 길이는 염기 analogues의 배양 시간에 비례합니다. (B) lysed DT40 세포에서 DNA는 현미경 슬라이드에 중력에 의해 늘어 및 법인 염기 analogues은 특정 항체 및 형광 현미경을 사용하여 시각 점입니다.
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그림 2. 대표 형광 이미지는 이후 이십분 각 이두와 CldU으로 표시 야생 유형 DT40 세포에서 섬유를 보여줍니다. 섬유의 대부분은 잘 서로 구분하기 때문에 쉽게 분석할 수 있습니다. 하얀 막대는 10 μm의를 나타냅니다.
. 그림 3 이중 라벨 섬유 기술은 하나가 다른 복제 구조를 구분할 수 있도록, 1 - 적극적으로 복제 포크, 2 - DNA 복제 (새 기원의 발포), 3의 새로운 사이트 - 포크 종단 (두 수렴 포크), 4 - interspersed 섬유 (붙어있는 기원의 장소) 및 5 - 지연 포크 (적색 신호 전용).
Discussion
우리는 단일 분자 수준에서 S - 단계 동안 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정량 분석을 위해 허용하는 방법을 설명합니다. 지난 10 년 동안, DNA 섬유 fluorography 기술의 여러 버전은 살아있는 세포 내의 개별 복제 포크의 움직임을 시각화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 모든 기술에 중요한 매개 변수는 잘 분리된 DNA 섬유를 제공하는 유리 표면에 DNA의 스트레칭 최상을 달성하는 데 사용되는 절차입니다. 이것을 달성하기위한 중요한 단계는 현미경 슬라이드뿐만 아니라 용해 시간에 세포 현탁액의 배양 시간입니다. 이러한 매개 변수는 특정 실험실에서 온도와 공기에 의존하고 경험적으로 결정되어야합니다. DNA 섬유 실험 실용적인 부분은 일반적으로 하루 만에 수행됩니다. 그러나, 이후의 그림 수집과 분석은 더 많은 시간이 소요됩니다 실천이 필요합니다.
라벨의 프로토콜은 광고 수다양한 과학 문제에 답변을 apted : 두 번째 펄스 라벨 동안 복제와 방해 에이전트를 사용하면 포크 신장 / replicative 스트레스에 대응 연기를 모니터합니다. 이 시나리오에서는 첫 번째 레이블이 두 번째 뉴클레오 티드로 씻겨 나간 할 필요가 없다는 초과에 추가됩니다. 또는 복제를 방해 약물은 조합 또는 첫 번째 레이블 외에 후 사용할 수 있습니다. 이것은 첫 번째 레이블을 필요로하고 두 번째 뉴클레오 티드 아날로그 전에 제거할 수있는 약물이 적용됩니다. 이 절차는 하나 replicative 스트레스의 조건 (예 : 포크가 연기 및 / 또는 붕괴) 아래 replicative 포크의 안정성 / 복구에 다양한 DNA 수리 요인의 중요성을 확인할 수 있습니다. 주목할만한, DNA 복제 프로그램의 세부 사항에 대한 자세한 분석은 현장 하이브 리다이 제이션에 빗질 DNA와 형광 결합 대체 접근법의 사용을 수행할 수 있습니다. 이것은 그러나, 기술적으로 더 도전하고 expen 필요sive 장비.
질적 및 양적 DNA 복제의 세부 사항을 분석할 수있는 능력은 DNA 복제 자체에 결함뿐만 아니라 복제 포크와 관련된 게놈 불안정성을 억제 경로를 조사를위한 필수적인 도구를 제공합니다. 의심의 여지가없이,이 분석은 더 이상 정상적인 세포가 반응 /뿐만 아니라 암 세포가 복제 포크를 대상으로 약물의 독성에 저항 이러한 메커니즘을 활용하는 방법으로 환경 변화에 적응할 수 있도록 복제 - 중재의 DNA 수리 메커니즘에 빛을 창고에 도움이 될 것입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 섬유 기술뿐만 아니라 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원과 관련하여 도움이 박사 T. Helleday 박사 E. Petermann 감사합니다. WN는 국제 암 연구 협회의 수석 국제 연구 활동에 의해 과학 연구 부여 (N301 165935)에 대한 폴란드 국가위원회에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
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