Summary
DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Replikasyon çatalı istikrar Bakım canlılığını korumak ve hastalığı önlemek için hücrelerin bölünmesi için büyük önem taşımaktadır. Ilgili süreçleri sadece endojen ve eksojen DNA hasarı karşısında sadık genom çoğaltılması sağlamak değil, aynı zamanda genomik instabilite, tümör gelişimini tanınmış bir etken faktörü engel değildir.
Burada, basit ve maliyet-etkin floresan mikroskopi tabanlı DT40 kuş B-hücre hattı DNA replikasyonu görselleştirmek için yöntem açıklanmaktadır. Bu hücre hattı, omurgalı hücreler 1 ters genetik in vivo protein fonksiyonunu araştırmak için güçlü bir araç sağlar . Belirli bir geni eksik DT40 hücrelerinde DNA lif Fluorografi biri bu gen ürünü, DNA replikasyonu ve genom istikrar fonksiyonu açıklamak için izin verir. Omurgalı hücreler replikasyon çatal dinamiklerini analiz etmek için geleneksel yöntemlerle bir nüfus darbe etiketli hücrelerinin DNA sentezi genel oranı ölçüm güveniyor. Bu niceliksel bir yaklaşımdır ve DNA sentezi etkileyen parametrelerin nitel analiz için izin vermiyor. Buna karşın, DNA fiber tekniği 2-4 kullanırken aktif çatal hareketinin hızı doğrudan takip edilebilir. Bu yaklaşımda, doğmakta olan DNA halojenli nükleotidler dahil (Şekil 1A), in vivo olarak etiketlenmiştir . Daha sonra bir mikroskop lamı üzerine, bireysel lifler gerilir ve etiketli DNA çoğaltma yolları spesifik antikor ile boyandı ve floresan mikroskobu (Şekil 1B) ile görünür. Çoğaltma gibi çatal yönlülük başlatılması, iki farklı analogları ardışık kullanımı ile belirlenir. Ayrıca, dual-etiketleme yaklaşımı S-fazında DNA sentezi etkileyen parametrelerin kantitatif analiz sağlar, yani devam eden ve durdu çatal, çoğaltma kökenli yoğunluğu yanı sıra çatal sonlandırmaları çoğaltma yapılar. Sonuç olarak, deneysel prosedür başarmak olabilir.ed, bir gün içinde sadece genel laboratuar cihazları ve floresan mikroskop gerektirir.
Protocol
Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5: Bu yöntem şu yayında kullanılan Burada anlatılan.
1. DT40 hücre Kültür
Malzemeler: Fetal sığır serumu (FBS), tavuk serumu, penisilin / streptomisin, 2 merkaptoetanol, RPMI
- Hücre kültürü ortamı hazırlayın:% 7 FBS eklemek,% 3 tavuk serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 10 mcM 2-merkaptoetanol RPMI medyum.
- DT40 hücreler steril hücre kültürü şişeleri yetiştirilen 38 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmelidir inkübatör. 5 x 5 10 hücre / ml 6 yoğunluğu her geçen gün hücreleri bölme.
2 in vivo etiketleme
Malzemeler: EUK, CldU
- Nükleotid analogları stok çözümleri hazırlayın: 5 mM ve CldU orta ve 2.5 mM IDU çözülür. Her iki çözümü de kısaca 60 Isı ° C ve nükleotid analog kadar vorteksues tamamen çözülür.
- 25 mcM DT40 hücreler katlanarak büyüyen bir final konsantrasyonu IDU ekleyin ve hücre süspansiyonu iyi karıştırın. 38 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri 20 dakika inkübe.
- Ilk etiket ile inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 250 mcM CldU eklemek ve önceki adımda açıklandığı gibi hücre tedavisi.
- Hücreleri buz PBS ile yıkayın ve 7.5 x 10 5 hücre / ml soğuk PBS bir konsantrasyon onları tekrar süspansiyon haline getirin. Etiketli hücreleri buz üzerinde tutun.
Açıklanan etiketleme işlemi sadece bir öneridir ve özel soruları yanıtlamak için modifiye edilebilir. Deneysel tasarım hakkında daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakınız.
3. Hücre parçalama ve DNA yayılıyor
Malzemeler: Cam slaytlar, lif lizis çözüm
- 200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA ve% 0.5 SDS: fiber lizis çözüm hazırlayın
- Pipetleyin 7 ul lizis hücre süspansiyonu çözüm ve çözümler karıştırmak için pipet ucu ile hafifçe karıştırın. Devam etmek için hücre erimesi için 2 dakika inkübe edin.
- 15 ° lifleri slayt yayılabilir izin slaytlar yatırın.
- Fiber çözümü slayt alt ulaştığında, kuru hava yatay olarak yerleştirin. Kuruduktan sonra ince, opak bir çizgi slayt boyunca görünür olmalıdır. Bu noktada, çizgi artık görünür olmayacak boyandıktan sonra gergin liflerin başında bir kalem ile işaretlenmiş olmalıdır. Bu işaret, daha sonra mikroskop altında lifleri bulmak için yardımcı olacaktır.
4. Immünofloresan boyaması
Malzemeler: Metanol, asetik asit, HCl, PBS içinde% 5 BSA, boyama kavanoz, anti-BrdU (fare) antikor,anti-BrdU (sıçan) antikor, koyun anti-fare Cy3 antikor, keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 antikor, Vectashield montaj orta lamelleri, oje
- Metanol / asetik asit (3:1), 10 dakika boyunca bir boyama kavanoz ve inkübe daldırın slaytlar.
- 80 dakika sonra 2.5 M HCl batırmayın distile H 2 O slaytlar, yıkayın.
- Yıkama 5 dakika PBS içinde üç kez slaytlar.
- Boyama kavanoz slaytları çıkarın ve kağıt havlu ile fazla PBS toplamak. Slaytları yatay olarak yerleştirin ve her slaytın üstüne pipetlemeyin% 5 BSA. BSA slayt üzerinde eşit biçimde yaymak ve 20 dakika boyunca inkübe slaytları bir lamel ile hafifçe örtün.
- 01:25 anti-BrdU (fare) ve 1:400 anti-BrdU (sıçan):% 5 BSA aşağıdaki konsantrasyonlarda primer antikorlar sulandırınız.
- Çıkarmak için cam slayt aşağı lamel yavaşça hareket ettirin. Kapak kayma slayt yapışıyor kuvvet uygulamayın. Lamel gevşek bir hale gelinceye kadar slayt PBS rehidrated kolaylıkla silinebilir. Bir kağıt havlu ile fazla BSA toplayın ve slaytlar yatay olarak yerleştirin. Her bir slayt üzerine primer antikor çözüm pipetleyin 50 ul. Slayt üzerinde eşit antikor çözüm yaymak ve nemlendirilmiş bir odasında 2 saat süreyle inkübe bir lamel ile tekrar örtün.
- Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak
- : Aşağıdaki konsantrasyonlarda 1:500 koyun anti-fare Cy3 ve 1:400 keçi anti-fare Alexa Fluor 488% 5 BSA sekonder antikor sulandırınız.
- 50 primer antikorlar için açıklandığı gibi ikincil antikor çözüm ul uygulayın. Işık ve 1 saat süreyle inkübe slaytlar koruyun.
- Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak.
- Her bir slayt üzerine Vectashield montaj orta bir damla ekleyin ve bir lamel uygulayın. Lamelleri hafifçe basın ve kağıt havlu ile çevresinde aşırı sıvı kaldırmak. Seal lamelleri şeffaf tırnak polish ve onlara kuru sağlar. -20 ° C'de slaytlar Mağaza
5. Görüntü elde etme
Malzemeler: floresan mikroskop, kamera
Kalem işareti yakın bir slayt üzerine bir damla immersiyon yağı koyun ve liflerin yerini başlayın. Tipik olarak, bir ana elyaf demeti, ancak bu liflerin çok dolaşmış ve daha sonra analiz edilemez. Lifleri (Şekil 2) birbirinden açıkça ayrılmış alanlar bulmak için ana paket uzağa taşıyın. Biz sadece önyargı önlemek için tek bir renk kanalı kullanarak resimleri seçmek. Sonra, her bir zaman noktasında, konsantrasyon veya hücre hattının yaklaşık 10 fotoğraf çekmek. Ancak, resimlerin sayısı her resmi sayılır kaç lifleri bağlıdır. Bir slayt bir bölge temsilcisi fiber uzunluğu veya çoğaltma yapıları sağlamak değil, farklı fotoğraf çekmek için slayt boyunca hareket ettirin.
6. Veri analizi
Malzemeler: Resim analiz programı, örneğin ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
İthalat bir resim analiz programı resim. Uzunlukları ölçün lif yolları ve / veya farklı çoğaltma yapıları sayısı (Şekil 3). Sadece resmin kenarına uzatmak açıkça görülebilir ve liflerin sayısı. Biz genellikle yaklaşık 100 liflerinin uzunluğu ölçmek ve 150-200 çoğaltma yapıların sayısı ve bireysel deneyler en az üç kez tekrarlayın.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Yeni çoğaltılmış DNA antikor etiketli nükleotid analogları hatları olarak görüntülenebilir. Deneyler devam eden bir çatal bitişik kırmızı ve yeşil sinyaller (Şekil 3) olarak temsil edilir. Çift etiketleme protokolü de bize çoğaltma yapıları dört ana sınıfı tanımlamak için izin verir: 1) yeni başlanması olayları divid olabilir hücreleri ilk etiket ve ikinci etiketi ile inkübasyon sırasında ateş kökenleri ile inkübe edildi ateş var kökenleri içine ed. Eski komşu, yeşil-kırmızı-yeşil sinyaller ve yeşil hat sadece ikinci oluşur. 2) fesih olaylar bitişik kırmızı-yeşil-kırmızı sinyaller olarak tezahür eder. 3) serpiştirilmiş kökenleri dizilmesinin kökeni ile genom siteleri. Bu tür siteler, ardışık kökenleri ve sonlandırma sinyalleri oluşur. 4), deneysel tasarım bağlı olarak durdu / çökmüş çatal ya da yalnızca kırmızı bir sinyal 7 veya daha kısa bir yeşil yolu 8,9 takip eden bir kırmızı çizgi olarak tarif edilebilir.
Koşullar vahşi tip DT40 hücreleri ortalama çatal hızı 0.4 mm / dak, burada açıklanan. Biz yaklaşık% 63,% 10 devam eden çatal kökenleri,% 16 durmuş çatal (kırmızı tek yollarında),% 8 sonlandırmaları ve% 3 serpiştirilmiş lifleri algılayabilir.
ure 1 "/>
Şekil 1 (A) karikatür sol tarafta DNA etiketleme prosedürünün ilk adımı anlatıyor: katlanarak büyüyor DT40 hücrelere IDU ekleyerek kolayca yeni sentezlenen DNA ipliklerini önde gelen ve geri kalmış dahil nükleotid analog açar. Bu spesifik antikor kullanarak görüntülendi olabilir ve mikroskop altında bakıldığında kırmızı bir çizgi olarak görünecektir. Daha sonra, bu rakam sağ tarafta gösterildiği gibi aynı prosedürü CldU tekrarlanır. Ikinci nükleotid analoğu ile inkübasyondan sonra, aktif bir çatal bitişik kırmızı-yeşil bir yolu olarak görülebilir. Ortalama lif uzunluğu nükleotid analogları inkübasyon süresi ile doğru orantılıdır. (B) parçalanan DT40 hücrelerin DNA, bir mikroskop lamı üzerine ağırlık gergin ve nükleotid analogları dahil spesifik antikorların kullanımı ve floresan mikroskobu tarafından görüntülenmiştir.
igure 2 "/>
Şekil 2 bir temsilci floresan görüntü daha sonra her 20 dakika için IDU ve CldU etiketli yabani tip DT40 hücreleri lif gösterir . Liflerinin çoğu birbirinden ayrılır ve böylece kolayca analiz edilebilir. 10 mikron beyaz çubuğu temsil eder.
Şekil 3 çift etiketleme fiber tekniği biri farklı çoğaltma yapıları arasında ayırt etmek için izin verir; 1 - aktif kopyalayan çatal, 2 - DNA replikasyonu (yeni kökeni ateş), 3 yeni siteleri - çatal sonlandırmaları (iki yakınsak çatal), 4 - serpiştirilmiş lifler (dizilmesinin kökeni siteleri) ve 5 - durmuş çatal (kırmızı sinyal).
Discussion
Biz tek bir molekül düzeyinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametrelerin kantitatif analiz için veren bir yöntem açıklanmaktadır. Geçtiğimiz on yıl içinde, DNA fiber Fluorografi tekniği farklı sürümleri, canlı hücreler içinde bireysel çoğaltma çatal hareket görselleştirmek için geliştirilmiştir. Tüm bu tekniklerin kritik parametre ayrılmış DNA liflerinin sağlayan cam yüzeyler üzerinde DNA uzanan mümkün olan en iyi ulaşmak için kullanılan bir işlemdir. Bunu başarmak için çok önemli bir adım mikroskop lamı gibi lizis zaman hücre süspansiyonu inkübasyon süresi. Bu parametreler, belirli bir laboratuarda sıcaklık ve hava akımı bağlıdır ve ampirik olarak tespit edilmelidir. DNA fiber deney pratik kısmı genellikle bir gün içinde gerçekleştirilir. Ancak, sonraki bir görüntü elde edilmesi ve analizi daha zaman alıcı ve pratik gerektirir.
Etiketleme protokol reklam olabilirçeşitli bilimsel sorunlara cevap Apted: ikinci darbe etiketleme sırasında çoğaltma engelleyen bir ajan kullanarak çatal uzama / replikatif stres yanıt durdurduklarını izler. Bu senaryoda, ilk etiket ikinci nükleotid olarak yıkanabilir gerekmez aşırı eklenir. Alternatif olarak, çoğaltma engelleyen ilaçların kombinasyonu ya da sadece ilk etiket eklenmesinden sonra kullanılabilir. Bu ilk etiket gerektirir ve ikinci nükleotid analog önce çıkarılması için ilaç uygulanır. Bu prosedür, bir replikatif stres koşulları altında (yani çatal durdurduklarını ve / veya daraltmak) replikatif çatal istikrar / kurtarma çeşitli DNA onarım faktörlerin önemini belirlemek için olanak sağlar. Kayda Değer, DNA replikasyonu programı özelliklerden penye DNA ve floresan in situ hibridizasyon birleştiren bir alternatif yaklaşımların kullanımı ile daha detaylı bir analiz yapılabilir. Ancak bu, teknik olarak daha zor ve pahalı gerektirirsive donanımları.
, Kalitatif ve kantitatif DNA replikasyonu hususlar analiz yeteneği, DNA replikasyonu kendisi kusurlar gibi çoğaltma çatal ile ilişkili genomik istikrarsızlık bastırmak yollar araştırıyor için gerekli bir araç sağlar. Kuşkusuz, bu testte daha normal hücrelere yanıt / kanser hücrelerini çoğaltma çatal hedefleyen ilaçların toksisitesi direnmek için bu mekanizmaları kullanan yanı sıra çevresel değişimlere uyum sağlayan çoğaltma aracılı DNA onarım mekanizmaları ışık tutacak yardımcı olacaktır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Dr T. Helleday fiber tekniği yanı sıra yararlı bir tartışma için laboratuar üyeleri ile yardım ve Dr E. Petermann teşekkür ederim. WN, Uluslararası Kanser Araştırma Derneği Kıdemli Uluslararası Araştırma Bursu ve Bilimsel Araştırma hibe (N301 165.935) Polonya Devlet Komitesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H.
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
