Summary
DT40, un système de modèle génétique des vertébrés, fournit un outil puissant pour analyser la fonction des protéines. Nous décrivons ici une méthode simple qui permet l'analyse qualitative des paramètres qui influencent la synthèse d'ADN lors de la phase S dans les cellules DT40 à l'échelle de la molécule unique.
Abstract
Maintien de la stabilité fourche de réplication est d'une importance capitale pour la division des cellules afin de préserver la viabilité et à prévenir la maladie. Les processus impliqués non seulement assurer la duplication du génome fidèles dans le visage de dommages à l'ADN endogènes et exogènes, mais aussi de prévenir l'instabilité génomique, un facteur reconnu de causalité dans le développement des tumeurs.
Ici, nous décrivons un microscope à base simple et rentable de fluorescence méthode pour visualiser la réplication de l'ADN dans le aviaire à cellules B en ligne DT40. Cette lignée cellulaire est un outil puissant pour étudier la fonction des protéines in vivo par génétique inverse dans les cellules de vertébrés 1. Fluorographie fibre de l'ADN dans des cellules dépourvues de DT40 un gène spécifique permet d'élucider la fonction des gènes dans ce produit réplication de l'ADN et la stabilité du génome. Les méthodes traditionnelles pour analyser la dynamique des fourches de réplication dans les cellules des vertébrés reposent sur la mesure du taux global de synthèse d'ADN dans une population de cellules marquées par impulsions. Ceci est une approche quantitative et ne permet pas pour l'analyse qualitative des paramètres qui influencent la synthèse d'ADN. En revanche, le taux de mouvement des fourches active peut être suivie directement en utilisant la technique des fibres d'ADN 2-4. Dans cette approche, l'ADN naissante est étiqueté in vivo par incorporation de nucléotides halogénés (figure 1A). Par la suite, les fibres individuelles sont étirées sur une lame de microscope, et les voies étiqueté réplication de l'ADN sont colorées avec des anticorps spécifiques et visualisé par microscopie à fluorescence (figure 1B). Initiation de la réplication ainsi que la directionnalité fourche est déterminée par l'utilisation successive de deux analogues différemment modifiés. Par ailleurs, l'approche à double étiquetage permet une analyse quantitative des paramètres qui influencent la synthèse de l'ADN lors de la phase S, les structures de la réplication à savoir comme les fourches en cours et calé, la densité origine de réplication ainsi que résiliations fourchette. Enfin, la procédure expérimentale peut être d'accomplired dans la journée, et ne requiert que du matériel de laboratoire général et d'un microscope à fluorescence.
Protocol
La méthode décrite ici a été utilisé dans la publication suivante: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 culture cellulaire
Matériaux: sérum fœtal bovin (FBS), du sérum de poulet, de pénicilline / streptomycine, 2-mercaptoéthanol, RPMI
- Préparer milieu de culture cellulaire: ajouter 7% de FBS, le poulet 3% de sérum, 1x pénicilline / streptomycine et 10 pM de 2-mercaptoéthanol à un milieu RPMI.
- DT40 cellules sont cultivées dans des flacons stériles de culture de cellules à 38 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur humidifié. Fractionner les cellules chaque jour à une densité de 5 x 10 5 cellules / ml 6.
2. Marquage in vivo
Matériaux: UDI, CldU
- Préparer des solutions étalons d'analogues de nucléotides: dissoudre UDI à 5 mm et CldU à 2,5 mM dans le milieu. Chauffer les deux solutions brièvement à 60 ° C et jusqu'à ce que le vortex analogue nucléotidiqueUES sont complètement dissous.
- Ajouter UDI à une concentration finale de 25 pM à la croissance exponentielle des cellules DT40 et mélanger la suspension cellulaire ainsi. Incuber les cellules pendant 20 minutes à 38 ° C et 5% de CO 2.
- Après incubation avec la première étiquette, ajouter CldU à une concentration finale de 250 uM et de traiter les cellules comme décrit dans l'étape précédente.
- Laver les cellules avec de la glace du PBS froid et les remettre en suspension à une concentration de 7,5 x 10 5 cellules / ml dans du PBS froid. Gardez les cellules marquées sur la glace.
La procédure d'étiquetage décrites n'est qu'une suggestion et peut être modifié pour répondre aux questions spécifiques. S'il vous plaît se référer à la section de discussion pour plus d'informations sur le design expérimental.
3. Lyse des cellules et l'ADN propagation
Matériaux: lames de verre, fibre de solution de lyse
- Préparer la solution de lyse des fibres: 50 mM d'EDTA et 0,5% de SDS dans 200 mM Tris-HCI, pH 7,5
- Pipet 7 solution de lyse ul sur le dessus de la suspension cellulaire et remuer doucement avec la pipette pour mélanger les solutions. Incuber pendant 2 minutes pour la lyse cellulaire de procéder.
- Tilt diapositives à 15 ° pour permettre aux fibres de se propager le long de la glissière.
- Une fois la solution fibre a atteint le fond de la diapositive, le placer horizontalement sécher à l'air. Après séchage, une fine ligne opaque devrait être visible le long de la glissière. A ce point, le début de l'fibres étirées doivent être marqués avec un crayon comme après coloration de la ligne ne sera pas visible plus longtemps. Cette marque sera plus tard aider à localiser les fibres sous le microscope.
4. Immunofluorescence
Matériaux: Le méthanol, l'acide acétique, l'acide chlorhydrique, BSA 5% dans le PBS, cuvette, anti-BrdU (souris) d'anticorps,anti-BrdU (rat) anticorps, mouton anti-souris Cy3 d'anticorps de chèvre anti-rat Alexa Fluor 488 anticorps, moyennes Vectashield montage, lamelles, vernis à ongles
- Immerger les lames dans du méthanol / acide acétique (3:1) dans une cuvette et incuber pendant 10 minutes.
- Laver les lames de H 2 O distillée, puis plonger dans HCl 2,5 M pendant 80 minutes.
- Laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes.
- Retirer les lames de la cuvette et de recueillir l'excès de PBS avec une serviette en papier. Placer les lames horizontalement et BSA pipette de 5% sur le dessus de chaque diapositive. Couvrir les lames délicatement avec une lamelle de répandre la BSA uniformément sur la lame et incuber pendant 20 minutes.
- Diluer l'anticorps primaire dans BSA 5% aux concentrations suivantes: 1h25 anti-BrdU (souris) et 1:400 anti-BrdU (rat).
- Déplacer la lamelle doucement la lame de verre pour l'enlever. Ne forcez pas si la lamelle colle à la lame. La lame peut être réhydratés dans du PBS jusqu'à ce que la lamelle se détache uneD peut être retiré avec facilité. Recueillir BSA excédent avec un papier absorbant et placer les diapositives à l'horizontale. Pipeter 50 pl de la solution d'anticorps primaire sur chaque diapositive. Couvrir à nouveau avec une lamelle de répandre la solution d'anticorps uniformément sur la lame et incuber dans une chambre humide pendant 2 heures.
- Après avoir enlevé les lamelles, laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes
- Diluer l'anticorps secondaire BSA 5% aux concentrations suivantes: 1:500 mouton anti-souris Cy3 et 1:400 chèvre anti-rat Alexa Fluor 488.
- Appliquer 50 pl de la solution d'anticorps secondaire comme décrit pour les anticorps primaires. Protéger les diapositives de la lumière et incuber pendant 1 heure.
- Après avoir enlevé les lamelles, laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes.
- Ajouter une goutte de milieu de montage sur Vectashield chaque diapositive et appliquer une lamelle. Appuyez doucement sur la lamelle et enlever l'excès de liquide autour de lui avec une serviette en papier. Sceller avec des lamelles transparentes ongles polish et les laisser sécher. Stocker les diapositives à -20 ° C.
5. L'acquisition des images
Matériaux: la fluorescence microscope, caméra
Déposer une goutte d'huile d'immersion sur une lame près de la marque au crayon et commencer localiser les fibres. Typiquement, il ya un faisceau de fibres principaux, mais ces fibres sont trop enchevêtrés et ne peut pas être analysé plus tard. S'éloigner du faisceau principal de trouver des zones où les fibres sont clairement séparées les unes des autres (fig. 2). Nous souhaitons sélectionner des images en utilisant uniquement un canal de couleur afin d'éviter les biais. Ensuite, nous faudrait environ 10 photos de chaque ligne de temps là, la concentration ou de la cellule. Toutefois, le nombre de photos dépend du nombre de fibres peuvent être comptés sur chaque image. Déplacer le long de la glissière de prendre les différentes images, comme un domaine d'une diapositive peut ne pas fournir des longueurs de fibre représentant ou des structures de réplication.
6. L'analyse des données
Matériaux: programme d'analyse d'image, par exemple ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Importer des images dans un programme d'analyse d'image. Mesurer la longueur des faisceaux de fibres et / ou compter les structures de réplication différentes (Fig 3). Ne compter que les fibres qui sont clairement visibles et qui ne s'étendent pas sur le bord de l'image. Nous généralement de mesurer la longueur d'environ 100 fibres et compter 150 à 200 structures de réplication et de nous répéter les expériences individuelles d'au moins trois fois.
7. Les résultats représentatifs:
L'ADN nouvellement répliqué peuvent être visualisées sous forme de lignes d'anticorps marqués analogues nucléotidiques. Dans nos expériences une fourche en cours est représentée comme adjacentes signaux rouge et vert (Fig. 3). Le protocole de double marquage nous permet également de définir quatre grandes catégories de structures de réplication: 1) des événements d'initiation de nouvelles peuvent être divId ED sur les origines qui ont tiré alors que les cellules ont été incubées avec la première étiquette et origines qui ont tiré pendant l'incubation avec la deuxième étiquette. Les premiers consistent en voisines vert-rouge-vert et les seconds signaux d'une ligne verte uniquement. 2) événements de résiliation manifester comme attenante rouge-vert-rouge signaux. 3) entrecoupées origines sont des sites dans le génome avec des origines très rapprochées. Ces sites comprennent des origines consécutifs et signaux de terminaison. 4) en fonction de la conception expérimentale, au point mort / fourches effondrée peut être défini comme un signal rouge à seulement 7 ou une ligne rouge suivie d'une courte voies vertes 8,9.
En utilisant les conditions décrites ici, les cellules de type sauvage DT40 ont une vitesse moyenne de la fourchette de 0,4 um / min. Nous pouvons détecter environ 63% fourches en cours, des origines à 10%, 16% fourches bloquées (rouge voies seulement), les résiliations de 8% et 3% de fibres entremêlées.
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. Figure 1 (A) Le côté gauche de la caricature illustre la première étape de la procédure de marquage de l'ADN: l'ajout d'UDI à la croissance exponentielle des cellules DT40 conduit l'analogue nucléotidique pour être facilement intégrés dans les principaux nouvellement synthétisées et le retard des brins d'ADN. Ceci peut être visualisé en utilisant un anticorps spécifique, et apparaîtra comme une ligne rouge lorsqu'on les examine sous le microscope. Par la suite, la même procédure est répétée avec CldU comme indiqué sur le côté droit de la figure. Après incubation avec l'analogue de nucléotides seconde, une fourche active sera visible comme une attenante rouge-vert voies. La longueur de la fibre moyenne est proportionnelle au temps d'incubation de la analogues nucléotidiques. (B) l'ADN de cellules lysées DT40 est étirée par gravité sur une lame de microscope et les analogues de nucléotides incorporés sont visualisés par l'utilisation d'anticorps spécifiques et la microscopie à fluorescence.
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Figure 2. Une image représentative de fluorescence montre des fibres à partir des cellules de type sauvage DT40 suite étiquetés avec UDI et CldU pendant 20 minutes chacun. La plupart des fibres sont bien séparés les uns des autres et peuvent donc facilement être analysés. La barre blanche représente 10 um.
. Figure 3 La technique de fibre double étiquetage permet de distinguer entre les structures de réplication différentes; 1 - fourches répliquant activement, 2 - de nouveaux sites de réplication de l'ADN (tirs de nouvelles origines), 3 - terminaisons fourche (deux fourchettes convergentes), 4 - fibres entremêlées (sites d'origines rapprochées) et 5 - fourches bloquées (rouge signal seulement).
Discussion
Nous décrivons une méthode qui permet une analyse quantitative des paramètres qui influencent la synthèse de l'ADN lors de la phase S à un niveau molécule unique. Au cours des dix dernières années, différentes versions de la technique de l'ADN fluorographie en fibre ont été développés pour visualiser le mouvement des fourches de réplication individuels au sein des cellules vivantes. Le paramètre critique dans toutes ces techniques est la procédure utilisée pour obtenir le meilleur étirement de l'ADN sur les surfaces en verre offrant fibres d'ADN bien séparées. Une étape cruciale pour parvenir à cela est le temps d'incubation de la suspension cellulaire sur la lame du microscope ainsi que le temps de lyse. Ces paramètres dépendent de la température et le débit dans un laboratoire particulier et doit être déterminé de manière empirique. La partie pratique d'une expérience de fibre d'ADN est en général accompli en une journée. Toutefois, l'acquisition d'image et l'analyse subséquentes est plus beaucoup de temps et exige la pratique.
Le protocole de marquage peut être adApted pour répondre à différents problèmes d'ordre scientifique: en utilisant un agent qui inhibe la réplication lors de la deuxième impulsion d'étiquetage des moniteurs allongement de fourche / décrochage en réponse au stress réplicatif. Dans ce scénario, le premier label n'a pas besoin d'être lavés comme le deuxième nucléotide est ajouté en excès. Alternativement, les médicaments qui empêchent la réplication peut être utilisé en combinaison ou juste après l'addition de la première étiquette. Cela nécessite d'abord l'étiquette et la drogue pour être enlevés avant l'analogue de nucléotides secondes est appliquée. Cette procédure permet de déterminer l'importance des différents facteurs sur la stabilité réparation de l'ADN de fourche réplicative / récupération dans des conditions de stress réplicatif (fourche à savoir caler et / ou l'effondrement). Il convient de noter, une analyse plus détaillée des particularités du programme réplication de l'ADN pourrait être effectuée avec l'utilisation d'une combinaison des approches alternatives peignage moléculaire et la fluorescence par hybridation in situ. Ceci, cependant, est techniquement plus difficile et exige dépenseséquipements excessive.
La capacité à analyser qualitativement et quantitativement détails de réplication de l'ADN fournit un outil essentiel pour étudier les défauts de réplication de l'ADN lui-même ainsi que les voies qui suppriment l'instabilité génomique associée avec des fourches de réplication. Sans aucun doute, ce test sera une aide supplémentaire pour faire la lumière sur les mécanismes de réplication à médiation réparation de l'ADN qui permettent aux cellules normales pour répondre / s'adapter aux changements environnementaux ainsi que la manière dont les cellules cancéreuses utilisent ces mécanismes de résister à la toxicité des médicaments ciblant les fourches de réplication.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr T. Helleday et le Dr E. Petermann de l'aide pour la technique des fibres ainsi que des membres du laboratoire de discussion utile. WN est soutenu par une bourse de recherche internationale senior de l'Association for Cancer Research International et par le Comité d'État polonais pour la recherche scientifique subvention (165 935 N301).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
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